皮肤切创愈合过程中TLR2、TLR4表达及其法医学意义

目的探讨皮肤切创组织中单核-巨噬细胞TLR2和TLR4阳性表达与损伤时间的相关性,以寻找损伤时间推断的新方法。方法应用免疫组织化学技术研究45例不同损伤时间小鼠皮肤切创组织中TLR2、TLR4的表达情况,同时以3例正常小鼠皮肤组织作对照。结果皮肤切创组织中单核-巨噬细胞TLR2和TLR4阳性表达与损伤时间具有相关性。单核-巨噬细胞TLR2、TLR4阳性细胞比率(单核-巨噬细胞阳性细胞数与中性粒细胞、单核-巨噬细胞及成纤维细胞三种阳性细胞总数之比率)与损伤时间的回归方程分别为y=23.8099 0.9572x-0.0077x2 1.5×10-5x3(R2=0.872);y=25.2256 0.7893x-0.0059x2 1.0×10-5x3(R2=0.879)。结论TLR2、TLR4在小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区内单核-巨噬细胞阳性表达比率与损伤时间相关;检测损伤区单核-巨噬细胞TLR2、TLR4的表达可望成为推断损伤时间的新方法。     

小鼠皮肤切创愈合过程中Ⅱ型大麻素受体的表达

目的观察皮肤切创愈合过程中CB2R表达变化的时问规律性。方法 健康小鼠50只,随机分为10组,建立皮肤切创模型,应用免疫组织化学技术及Westernbloting方法检测切创后不同时间段小鼠背部正中皮肤CB2R的表达。结果免疫组织化学结果显示,对照组CB2R表达于表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌层、血管平滑肌、神经纤维外膜及神经纤维束束膜;伤后6h损伤区及周边区多核粒细胞少量表达CB2R,12～24h以单个核细胞阳性表达为主,3d以单个核细胞和梭形成纤维细胞表达为主,5～14d以梭形成纤维细胞为主。CB2R阳性细胞率于0h～3d逐渐升高,5d达最高峰,随后逐渐下降。经Westernblotting检测显示,对照及各个损伤时间段都有CB2R阳性条带,其中5d为CB2R表达高峰。结论小鼠皮肤切创愈合过程中,CB2R于损伤区及周边区多核粒细胞、单个核细胞、梭形成纤维细胞中表达,并具有规律性,提示CB2R可能参与皮肤损伤愈合,并可用于皮肤损伤时间的推断。     

人皮肤成纤维细胞早期损伤后EDA-FN表达与损伤时间的关系

目的探讨培养的人体皮肤成纤维细胞损伤后纤维连接蛋白EDA片段的表达情况与损伤时间的关系。方法培养人体皮肤成纤维细胞,利用单克隆抗体进行免疫组织化学染色及Western检测。结果培养中的人体成纤维细胞可以微量表达EDA,随损伤时间延长而表达量增加。结论EDA片段表达变化可以作为法医学早期损伤时间推断的比较理想的指标。     

FN-EIIIA肽段表达与皮肤损伤时间推断研究

目的 在mRNA研究的基础上,研究大鼠皮肤挫伤后含EIIIA□段的Fn蛋白水平表达与损伤时间关系。方法片段特异性单克隆抗体免疫组织化学染色。结果伤后6h表皮细胞、毛囊上皮细胞等出现棕黄色阳性染色颗粒,并随损伤时间延长染色加深。结论Fn-EIIIA片段检测可用于法医学生前伤确认和损伤时间推断。     

皮肤切创愈合中caspase-3表达的免疫组化研究

目的探讨皮肤切创损伤愈合过程中,caspase-3在损伤区内的表达以及不同损伤时间caspase-3的变化规律。方法应用免疫组织化学技术对33例不同损伤时间小鼠皮肤切创组织中caspase-3的表达进行研究。同时以3例非切创小鼠皮肤组织做对照。结果伤后6h的损伤皮肤组织中可见少量中性粒细胞表达caspase-3,伤后12～24h,大部分浸润的中性粒细胞及部分单核细胞为caspase-3阳性。随伤后时间延长,caspase-3阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。伤后0～3h,caspase-3阳性细胞比率较低,为(4.53±6.53)%,12h后逐渐增加,伤后3d达高峰,为(62.66±4.84)%,其后逐渐下降。结论小鼠皮肤损伤愈合过程中,caspase-3可能在诱导损伤区内中性粒细胞、单核巨噬细胞及成纤维细胞发生凋亡过程中发挥重要作用,同时,caspase-3的规律性表达可用于损伤时间的推断。     

大鼠皮肤降钙素基因相关肽表达与损伤时间的相关性

目的探讨创伤皮肤组织降钙素基因相关肽(CGRP)的时间相关性表达,为损伤时间推断提供实验依据。方法应用免疫组化技术、图像分析技术和原位分子杂交技术检测不同损伤时间大鼠皮肤组织生前及死后CGRP表达。结果生前组大鼠损伤后皮肤组织内CGRP在神经纤维中表达明显高于对照组(P<0.05)。死后组皮肤组织中CGRP表达与正常对照组比较无明显变化(P>0.05)。生前组中CGRP表达在损伤后1h明显增多,4h达到高峰,以后恢复到正常。结论损伤组织神经纤维中CGRP表达具有规律性且有较好的时间相关性,可成为法医学损伤时间推断的指标。     

小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-6、-7表达的免疫组织化学研究

目的　观察皮肤切创损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内的表达及其变化规律。方法　应用免疫组织化学技术观察伤后不同时间小鼠皮肤切创组织中caspase 6、 7的表达 ,以非切创小鼠皮肤组织作对照。 结果　伤后 6h的损伤皮肤组织中可见少量多核粒细胞表达caspase 6、 7,伤后 12～ 2 4h ,大部分浸润的多核粒细胞及部分单核细胞为caspase 6、 7阳性。随伤后时间延长 ,caspase 6、 7阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。伤后 0～ 3h ,caspase 6、 7阳性细胞比率较低 ,12h后逐渐增加 ,伤后 3d达高峰 ,其后逐渐下降。 结论　小鼠皮肤损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内中性粒细胞 ,单核细胞及成纤维细胞中表达 ,其时序性变化规律可望用于皮肤损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-8表达的研究

目的检测皮肤切创愈合过程中caspase-8的表达,探讨用caspase-8表达的规律推测皮肤损伤时间。方法建立小鼠皮肤切创模型,应用免疫组织化学技术和Western blot方法检测切创后不同时间皮肤中caspase-8的表达,以未切创小鼠皮肤组织作对照。结果伤后12~24h的损伤皮肤组织中部分单核细胞表达caspase-8。随伤后时间延长,caspase-8阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。结论伤后3~6h,caspase-8阳性细胞比率较低,12h后逐渐升高,3d达到高峰,以后逐渐下降。实验组中,1、3、5、7d组可见明显的caspase-8活化片段,位于分子量Marker44/42处。结论小鼠皮肤切创愈合过程中,caspase-8在损伤区单核细胞及成纤维细胞中表达,其时序性变化规律可望用于皮肤损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创黏着斑激酶和磷酸化黏着斑激酶的表达及其变化规律

目的研究小鼠皮肤切创愈合过程中,黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）和磷酸化黏着斑激酶（phospho—FAK,p—FAK）在损伤区及损伤周边区内的表达及其变化规律。方法应用免疫组织化学染色技术和免疫印迹（Western blot）方法观察小鼠背部切创后损伤区及损伤周边区FAK及p-FAK的表达情况。结果伤后3h,FAK和p-FAK主要表达于多核粒细胞;伤后6～24h,主要表达于大部分浸润的多核粒细胞和单核细胞;伤后3～14d。主要表达于单核细胞和成纤维细胞。伤后FAK的阳性细胞率逐渐增高．于3d达到高峰．随后迅速下降;伤后p-FAK的阳性细胞率也逐渐增加,于12h达到高峰,之后逐渐下降。Westernblot结果显示,正常皮肤中FAK及P—FAK均有表达。FAK表达强度变化不是十分明显,但仍可见在3d时含量达到最高。p-FAK蛋白含量伤后逐渐增加．12h表达最强,随后逐渐下降。结论在小鼠皮肤切创愈合过程中,FAK和p-FAK阳性细胞率呈时间规律性变化．可用于皮肤切创损伤时间的推断。p-FAK呈现出明显的时间规律性变化,说明作为皮肤损伤时间的推断指标要优于FAK。     

IL-33在小鼠皮肤创伤后损伤时间推断中的作用

目的通过观察白细胞介素-33(interleukin-33,IL-33)在皮肤创伤后的时序性变化规律,探讨IL-33在法医学实践中用于损伤时间推断的应用价值。方法利用直径为5mm的圆形锉刀在小鼠背部建造皮肤损伤模型,于伤后1h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d取损伤处组织,对照组在与创伤组小鼠相同部位取同等大小的皮肤样本。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察皮肤创伤后愈合过程中的形态学变化,通过Western印迹法、免疫组织化学染色和双重免疫荧光染色法检测皮肤创伤样本IL-33的表达变化。结果Western印迹法结果显示,伤后3h,IL-33蛋白表达稍有下降,6h后IL-33蛋白表达逐渐增加,于伤后3d达峰值,随后逐渐减少。免疫组织化学染色结果显示,在对照组皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺及真皮中固有细胞有少量IL-33阳性表达,伤后3h,IL-33阳性细胞率开始增加,伤后3d达到峰值,随后逐渐减少。双重免疫荧光染色结果显示,伤后1~3d,IL-33阳性表达细胞主要为巨噬细胞,伤后5~7d,IL-33阳性表达细胞主要为肌成纤维细胞。HE染色结果显示该皮肤损伤模型创口愈合过程符合炎症的病理学发展规律。结论IL-33有望成为法医学推断皮肤损伤时间的参考指标。     

A preliminary study on the changes of expression of PDGF-beta,PDGFR-beta,TGF-beta 1, TGFR,bFGF and its relationship with the wound age in wound healing

OBJECTIVE: To explore the relationship between the expression change of cytokines and the wound age during the healing process of rats skin wound. METHODS: Immunohistochemical and image-analysis methods were performed on vital skin wounds(after incision 0.5-168 h am) and postmortem damage(after incision 0.5-6 h pm). RESULTS: The expression of the cytokines PDGF-beta, PDGFR-beta, TGF-beta 1, and bFGF in the epithelial cells was already enhanced since 0.5 h am after damage and their strongest expression reaction was seen at 24-96 h am. In addition, the expression of PDGF-beta, PDGFR-beta, TGF-beta 1 and bFGF was also found in the macrophages and the fibroblasts of the granulation tissue, and the expression changes in the postmortem damage group showed that the skin tissue within 0.5-3 h after incision showed immunohistochemical changes but weakly expression and 3 h thereafter no any change was found. CONCLUSION: The expression characteristics of the above mentioned cytokines in wound repair should be related to the wound age and it reminds therefore that they may be used as immunohistochemical criteria for accurate determining the wound age.     

蛋白因子与皮肤损伤时间的相关性研究

皮肤创伤愈合是一个复杂的过程,黏附分子、细胞因子等蛋白因子在该过程中发挥重要作用,常随损伤时间的延长呈现规律性表达。对这些蛋白因子在皮肤损伤后的表达变化进行深入研究,可以为法医学皮肤损伤时间推断以及临床皮肤损伤的修复提供新思路。本文对黏附分子、细胞因子等蛋白因子应用于皮肤损伤时间推断研究的国内外研究现状进行了综述,以供今后检案及研究借鉴。     

巨噬细胞在损伤时间推断中的作用

综述了近年来巨噬细胞在损伤时间推断中的法医学作用的研究进展。论述了巨噬细胞源性细胞因子的表达、巨噬细胞表型的变化和巨噬细胞吞噬物的演化等变化与损伤时间的关系,认为巨噬细胞在损伤修复中的特征性变化可作为损伤时间推断的新指标,具有深入研究的必要。     

人体皮肤各类创伤区纤维连接蛋白免疫组织化学的研究

本文应用免疫组织化学ＰＡＰ法对人体皮肤的切创、枪弹创、挫伤、挫裂创进行了ＦＮ染色观察研究，发现不同类型的创伤，由于致伤条件不同，即使创伤所经历的时间相同，而不同创伤区ＦＮ阳性染色的宽度和深度并不一样。     

Transforming growth factors (TGF-alpha and TGF-beta1) in the determination of vitality and wound age: immunohistochemical study on human skin wounds

In continuation of former investigations on proinflammatory cytokines, in the present study the relevance of the transforming growth factors TGF-alpha and TGF-beta1 was evaluated for the diagnosis of vitality and wound age. Paraffin sections from human skin wounds due to sharp force influence, which had been collected in operations and autopsies, were investigated using immunohistochemistry. The wound age varied from a few minutes to a maximum of 6 weeks with focus on the early post-traumatic interval up to 5h. Samples from uninjured skin were available as controls. TGF-alpha (n=74) was weakly expressed in normal skin and showed a marked increase in epidermal reactivity after a wound age of approximately 10 min. The maximum was between 30 and 60 min. TGF-beta1 (n=51) revealed constitutional expression only in connective tissue. An increase of immunohistochemical reaction was partially detected even in classical stab wounds (wound age of several minutes). The immunohistochemically detectable signal concerned--presumably due to an infiltration with TGF-beta-rich thrombocytes--large parts of the traumatized skin and also the epidermal layers (cellular and interstitial marking). TGF-beta1 peaked after a post-traumatic interval of 30-60 min. Both factors, especially TGF-beta1, remained detectable in elevated levels also in older wounds with an age of days to weeks (network in granulation tissue). TGF-alpha and TGF-beta1 can efficiently contribute to the estimation of vitality and wound age based on the evaluation of cytokine patterns. In particular, this applies to TGF-beta1 because of its easier evaluation and rapid up-regulation. Similar to other cytokines, the parallel investigation of control skin from the same individual must be recommended to eliminate variation in the basal expression.     

小鼠皮肤切创后不同时间的Tenascin免疫组化染色变化

目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中Tenascin表达变化及其与损伤时间的关系。方法制作小鼠背部全层皮肤切创模型,于伤后1、3、6、12h,1、3、6、9、12d分别观察切创周围皮肤、创缘皮肤及创腔肉芽组织的Tenascin免疫组化染色反应,并用图像分析技术检测Tenascin阳性染色的平均光密度,所得数据用SPSS for Windows 10.0软件包进行统计学分析。对照用无切创皮肤。结果对照组仅见真皮乳头、毛囊免疫组化染色弱阳性反应;伤后3h在切创周围的真皮乳头及毛囊Tenascin阳性染色增加;伤后12h明显增强,1~3d达最大值(0.336±0.061;0.282±0.017);伤后6d染色强度开始减弱,9~12d基本恢复正常。创缘皮肤及创腔肉芽组织伤后3~6h开始出现Tenascin阳性着色,12h明显增强,6d达最大值(0.410±0.051;0.460±0.027);伤后9d阳性着色开始减弱,12d基本恢复正常。结论小鼠皮肤切创愈合过程中产生的Tenascin随损伤时间呈现一定的规律性变化。