厚垣普可尼亚菌胞外蛋白酶的诱导及发酵液生化性质的研究

为探讨不同培养基对厚垣普可尼亚菌胞外蛋白质的诱导效果及相应发酵液的生化性质,以更好地利用该菌对家畜寄生性线虫进行生物防治,在本实验室前期研究的基础上,设计使用3种常用真菌液体培养基对厚垣普可尼亚菌进行发酵培养,并检测发酵液的蛋白质质量浓度、蛋白酶活性,磷酸酶活性及杀虫效力等,筛选出适合该菌液体培养的最佳培养基。结果表明,在3组培养基中,LMZ培养基组的蛋白质种类最丰富,蛋白质质量浓度(2 320 mg/L±10.00 mg/L)、蛋白酶活性(2.95 U/m L±0.23 U/m L)与磷酸酶活性[1.546 U/100 m L±0.035 U/100 m L(酸性磷酸酶)和0.516 U/100 m L±0.069 U/100 m L(碱性磷酸酶)]都较高,对线虫的杀虫率也是3种培养基中最高的,可达60%,与其他各组间差异极显著(P0.01)。因此从生物防治的角度,在试验的3种培养基中,以LMZ液体培养基为最佳选择。这一发现可为今后对厚垣普可尼亚菌液体发酵培养、杀虫物质的产生以及作用机制进行深入探究提供重要基础资料。     

捕食性真菌Duddingtonia flagrans线虫诱导发酵液的蛋白质组学分析

捕食性真菌Duddingtonia flagrans杀虫机理是近年来生物防制领域的热点,而对其发酵液中的蛋白质组进行深入分析和研究,有利于揭示D.flagrans杀线虫的生化机制。本研究首次采用基于液质联用的蛋白质组学非标记定量(label free)技术,对线虫幼虫诱导下的D.flagrans发酵液与普通营养菌丝发酵液进行了大规模蛋白质表达相对定量分析。结果,共鉴定出蛋白质258个,其中46个为显著差异表达蛋白质。进一步对差异蛋白质进行GO注释,结果表明,经线虫幼虫诱导的D.flagrans发酵液中差异蛋白参与的蛋白功能和生物学过程更加多样,以催化和结合功能为主,同时还参与感知环境刺激、信号转导、过氧化活性及胞壁合成等过程。进一步分析表明,与对照组相比,过氧化氢酶和三羧酸循环中柠檬酸甲酯合酶前体上调表达加快了有氧呼吸,推测D.flagrans分泌胞外蛋白酶还需要氧化应激。此外,丝氨酸酶与酪氨酸酶前体显著差异表达,可能该类酶是D.flagrans侵染线虫的重要毒力因子。KEGG代谢通路分析表明,差异蛋白还主要参与了糖、脂质和氨基酸等初级产物以及次级代谢物的合成与代谢过程。通过对差异蛋白质组的深入解析和研究,有利于揭示D.flagrans对线虫的作用机理,为应用D.flagrans对线虫生物防控提供了强有力的支撑。     

捕食性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白质的生化性质研究

为纯化捕食性真菌Duddingtonia flagrans分泌的胞外蛋白酶并研究其生化性质,利用枸橼酸液体培养基对D.flagrans进行培养,以灭菌的马圆线虫进行诱导,之后用盐析法粗提培养液,再使用Sephadex G-100分子筛进行层析纯化,最后对纯化物进行最适pH、温度及蛋白酶抑制剂的抑制试验。结果显示,被纯化出的3种胞外蛋白酶的分子质量分别为38、63、19ku;在pH 6.0~7.0、45~55℃条件下,其活性最高;它们都对酶抑制剂菲罗啉和抑肽素非常敏感,其中38ku的蛋白酶对抑制剂PMSF也很敏感。上述结果为进一步研究捕食性真菌分泌的胞外蛋白酶在杀线虫过程中的作用以及今后在生产中的具体应用提供了重要参考依据。     

少孢节丛孢菌胞外蛋白酶的诱导与生化性质

应用不同诱导剂和不同营养组成的液体培养基诱导培养捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌产生发酵液,经浓缩处理后,对发酵液中的蛋白质含量、酶活性以及相关的生化性质进行了测定。结果表明,培养基的组成成分和相关诱导剂能够显著影响少孢节丛孢菌的代谢过程;而且秀丽新杆线虫刺激少孢节丛孢菌产生的培养基滤液和氨基酸刺激所产生的发酵液内含成分不同;蛋白酶活性越高的滤液中,磷酸酶活性越低;产生胞外蛋白酶的最佳培养时间为6d。     

捕食线虫性真菌生长特性的研究

对捕食线虫性真菌菌丝、分生孢子、厚垣孢子、捕食性结构的发育过程和特点及其在 0 .4g/L玉米粉琼脂固体培养基和液体培养基中的生长情况进行了研究。结果表明 ,捕食线虫性真菌菌丝在 0 .4 g/L玉米粉琼脂固体培养基上呈树枝形放射状生长 ,有的菌株还可以在 0 .4g/L 玉米粉液体培养基中呈絮状生长 ;分生孢子位于垂直的分生孢子梗顶端或近顶端部 ,多数出现在菌丝的生长后期 ;厚垣孢子在菌丝上呈插入性生长 ,在老的培养基中容易发现 ,且与捕食线虫性真菌的种类有关 ;捕食性结构在受到活线虫幼虫的刺激之后才会产生 ,而线虫虫卵与成虫并不能导致捕食性结构的产生。     

少孢节丛孢菌Aoz1基因的生物信息学分析及原核表达条件的优化

为获悉少孢节丛孢菌内蒙古株Aoz1基因的详细信息,以研究捕食线虫性真菌对线虫的作用机制,本试验以捕食线虫性真菌的代表种——少孢节丛孢菌内蒙古株为研究对象,首先扩增其胞外丝氨酸蛋白酶的基因编码序列,并进行生物信息学分析,然后将其构建至原核表达载体pET-32a中,再转化至Transetta(DE3)表达感受态细胞中,进行表达条件的优化以及表达产物的纯化。结果表明,少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶Aoz1基因与已发表的丝氨酸蛋白酶Aoz1基因的同源性为99%,其蛋白具备螺旋结构;在原核系统中进行表达,其最适IPTG诱导浓度为1.5 mmol/L,最佳诱导时间为8 h,确定了重组蛋白的最佳表达条件,并获得了重组蛋白。对该酶基因的分析,为后续有关蛋白酶和捕食线虫性真菌杀灭寄生性线虫机理方面的研究提供了参考资料。     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

鞭式达丁屯氏菌对捻转血矛线虫感染性幼虫及秀丽隐杆线虫作用的动态观察

用光学显微镜和扫描电镜研究鞭式达丁屯氏菌对捻转血矛线虫感染性幼虫(L3)和秀丽隐杆线虫的动态作用。将鞭式达丁屯氏菌接种在0.2g/L玉米粉培养基中,培养7d后,加入试验线虫,在虫体刚被捕捉时即开始记为0h,此后分别于第1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、36和48小时取样观察。结果显示,该菌培养后可自发形成捕食结构;加虫30min后即有虫体被捕捉;捕捉后第4小时,菌丝侵入秀丽隐杆线虫导致死亡,而捻转血矛线虫L3被菌丝侵入致死亡则需要20~24h;捕捉后第24小时,整个秀丽隐杆线虫被菌丝侵占并完全消化;而捻转血矛线虫L3则需要36h被菌丝完全侵占,48h被完全消化。以上结果为进一步探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理提供科学依据。     

少孢节丛孢菌粗蛋白和氨基酸含量的测定

采用常规的粗蛋白和氨基酸分析方法,分别测定了含捕食器茵丝(含有普通营养菌丝、菌环和菌网)、普通营养菌丝、分生孢子、线虫三期幼虫的粗蛋白和氨基酸含量.结果显示,粗蛋白含量在含捕食器菌丝、普通营养菌丝、分生孢子和三期幼虫中分别为43.08%、33.65%、39.30%和65.91%.氨基酸的总量分别为31.859 mg/100 mg、20.584 mg/100 mg、32.111 mg/100 mg和44.077 mg/100 mg.上述样品中,均未测出色氨酸的含量.结果表明,少孢节丛孢菌捕食器的粗蛋白高于普通营养茵丝或分生孢子的粗蛋白含量,而线虫三期幼虫的粗蛋白含量最高.并且在含捕食器菌丝和线虫三期幼虫中,缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸以及酪氨酸的含量都比普通营养菌丝及分生孢子中的含量高,而前3种氨基酸据认为与捕食性真菌产生捕食器有关.     

秀丽隐杆线虫的培养与保存研究

比较了在OP50-NGM、JM109-NGM、OP50-LB、JM109-LB四种不同培养基上秀丽隐杆线虫的生长效果;测定了在三种温度和含不同甘油浓度冻存液中的虫体保存效果。结果显示,秀丽隐杆线虫在OP50-NGM培养基中生长良好,在JM109-LB培养基中生长较差。在-80℃最佳温度条件下,秀丽隐杆线虫在含50mL/L甘油的LB培养基中的存活率达78%;在含50mL/L甘油的PBS中的存活率达52%;而在含100mL/L甘油的水溶液中的存活率仅为8%。用液氮保存,成虫和幼虫均可存活;而在-80℃和-20℃条件下,仅有幼虫存活。结果表明,秀丽隐杆线虫在OP50-NGM培养基中培养发育生长较好;在-80℃条件下,含50mL/L甘油的LB培养基适于保存秀丽隐杆线虫。     

奇妙节丛孢的分离及对捻转血矛线虫幼虫和秀丽隐杆线虫捕食过程的观察

本研究从牛羊放牧草地土壤、粪堆、厩舍土壤及林地土壤中分离捕食线虫性真菌奇妙节丛孢菌(Arthrobotrys thaumasia),并进一步了解分离株对线虫的捕食过程。首先,使用诱饵平板技术分离奇妙节丛孢菌;然后,借助扫描电镜对NBS005分离株与绵羊捻转血矛线虫的幼虫及自由生活线虫秀丽隐杆线虫的捕杀动态学及相互作用进行观察。结果显示,在1 532份与牛羊相关的样品中分离出11株奇妙节丛孢菌,检出率为0.71%(11/1 532)。扫描电镜观察显示,加入试验线虫后第6小时,该菌产生捕食结构并开始捕捉试验线虫。其中,二期幼虫(L2)于捕捉后第8小时被真菌刺入角质层,第30小时虫体明显皱缩,提示虫体正处于消化过程,第78小时虫体被消化完全;第三期的感染性幼虫(L3)于捕捉后第12小时被真菌穿透,第42小时虫体表面皱缩,第84小时虫体消化完全;秀丽隐杆线虫于捕捉后第7小时被真菌刺入并明显皱缩,第12小时虫体严重皱缩,第18小时消化完全。以上结果表明,本研究中所分离的真菌属于奇妙节丛孢菌,该菌捕捉以上三种类型的线虫后,真菌对线虫捕食作用的时间随着线虫类型不同而有差异。     

多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶基因的原核表达及其表达产物的酶学活性分析

为探讨多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶(C u/Zn-SO D)基因的特征及该酶在多头带绦虫上的抗氧化作用,采用RT-PCR技术扩增脑多头蚴C u/Zn-SO D基因,构建原核表达载体p ET-32a-C u/Zn-SO D;然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达;对表达产物进行W estern-blot检测,并进行酶比活性分析。结果显示,多头带绦虫C u/Zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列与猪带绦虫和肥头绦虫C u/Zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列的相似性分别为98%和92%;纯化后的多头带绦虫重组Cu/Zn-SOD蛋白的浓度为1.587 m g/m L;用羟胺法测得该重组蛋白的酶比活性为3 125.64 U/mg±76.82 U/mg;H2O2、SDS和EDTA对重组的多头带绦虫Cu/Zn-SOD的酶活性具有较强的抑制作用,而氯仿-乙醇和脲素则对多头带绦虫Cu/Zn-SOD的酶活性并无影响。上述结果为进一步研究多头带绦虫C u/Zn-SO D基因的生物学功能奠定了基础。     

重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子.优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表达量占总蛋白的28.3%.表达产物主要以包涵体形式存在,用高浓度变性剂溶解后,采用Sephadex G50凝胶过滤一步复性并纯化重组鸡IFN-α,纯度可达98%以上.每1 L培养基可以得到47.1 mg的重组鸡IFN-α,产出率达34.14%.表达的重组鸡IFN-α在CEF/NDV检测系统上的比活性为1.12×10~8U/mg.     

传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡IL-18成熟蛋白基因在杆状病毒表达系统中的双表达

为了研制针对传染性法氏囊病病毒(IBDV)的新型疫苗,将IBDV的VP2基因和鸡IL-18成熟蛋白(mChIL-18)基因分别插入到双表达载体pFastBacDual的启动子P10和PH的下游,构建重组转移质粒pFastBacDual-VP2-IL-18。将其转座入大肠杆菌DH10Bac,获得了重组杆状病毒质粒,然后在昆虫细胞Sf9中双表达VP2-IL-18蛋白,并对双表达的VP2-IL-18进行生物学活性测定。结果显示,同一细胞中能分别表达出VP2蛋白和鸡IL-18蛋白,且表达的蛋白位于细胞胞质内。当VP2-IL-18的质量浓度为200ng/mL时能刺激鸡脾淋巴细胞产生IFN-γ,IFN-γ的活性最高可达2.8×104 U/mL。当VP2-IL-18诱导产生的IFN-γ的浓度≥10U/mL时就能产生抑制水泡性口炎病毒的效果。结果表明,双表达蛋白VP2-IL-18可以产生较强的生物学活性,为研制新型传染性法氏囊病IBD疫苗奠定了基础。     

新生仔猪大肠埃希氏菌性腹泻K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗生产工艺的研究

以实验室工艺为基础,用发酵罐培养,对培养基、诱导剂及诱导条件、通气量、菌液灭活条件等进行了筛选优化。结果表明,重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)培养的最适培养基为改良LB培养基;乳糖为适合于工业化生产的诱导剂,其最适浓度为100 mmol/L,诱导时间不低于6 h;2×105mL发酵罐培养的最佳通气量为500 L/min;培养菌液的灭活条件为按菌液总量加入4 mL/L甲醛溶液,37℃灭活48 h。按上述工业化生产条件生产疫苗5批,检验结果均安全有效。     

旋毛虫组织蛋白酶B基因TsCB1的克隆与生物信息学分析

为了研究旋毛虫组织蛋白酶B的功能,对GenBank中旋毛虫基因组数据库和EST数据库进行检索,获得旋毛虫组织蛋白酶B的cDNA序列并设计引物。以旋毛虫肌幼虫总RNA为模板,进行RT-PCR,将PCR产物克隆到pMD18-T载体后测序并进行生物信息学分析。结果表明,成功克隆到旋毛虫组织蛋白酶B基因(TsCB1)的cDNA序列,TsCB1cDNA含有1个由1 449个核苷酸组成的完整的开放阅读框,编码482个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量理论值为55.1ku,理论等电点为7.66。TsCB1第1～35位氨基酸残基为信号肽序列,有2个潜在的N-糖基化位点,具有1个生长调节素B结构域和半胱氨酸蛋白酶结构域,半胱氨酸残基活性位点被丝氨酸残基所替换,同源性分析表明与其他线虫组织蛋白酶B的一致性在60%左右。     

阿散酸在猪体内的药动学与生物利用度研究

选用体重25 kg左右的长×大二元杂健康猪8头,按双周期双交叉试验设计,进行静脉注射与内服阿散酸(10 mg/kg)的药动学研究。采用高效液相色谱法测定猪血浆中阿散酸的浓度,用统计矩原理处理血浆药物浓度-时间数据。结果显示:健康猪静脉注射阿散酸后的主要药动学参数为β=0.55 h-1±0.01h-1,t1/2β=1.26h±0.03 h,Vz=0.30L/kg±0.01 L/kg,Vdss=0.29 L/kg±0.01 L/kg,CL=0.17 L/(kg.h)±0.01 L/(kg.h),MRT=1.75 h±0.07 h,AUC=60.44μg/mL.h±0.01μg/mL.h;内服给药的主要药动学参数为β=0.39 h-1±0.02 h-1,t1/2β=1.79 h±0.09 h,tmax=1.81 h±0.09 h,Cmax=3.43μg/mL±0.53μg/mL,MRT=3.95 h±0.13 h,AUC=15.12μg/mL.h±0.01μg/mL.h,F=24.5%±3.4%。研究结果表明,阿散酸在健康猪体内的药动学特征为内服吸收迅速,血药浓度达峰时间短,但药物峰浓度低,绝对生物利用度低,消除快...     

采用特异性探针药物法对双峰驼CYP1A酶体外活性的测定

为探究双峰驼CYP1A酶体外活性及其对外源性药物代谢的影响,首先采用差速离心法制备双峰驼肝微粒体,并优化其体外孵育体系,然后采用高效液相色谱紫外检测法测定双峰驼肝微粒体孵育体系中CYP1A酶特异性底物非那西丁的代谢产物对乙酰氨基酚的动态含量,并借助Origin Pro8.6软件计算CYP1A酶的动力学参数。结果表明,双峰驼肝微粒体具有良好的酶活性,其蛋白质含量为1.652mg/g±0.341mg/g。经优化后孵育体系的最适宜底物的质量浓度为200μg/mL,最佳肝微粒体的质量浓度为4.95mg/mL,最适宜孵育时间为30min。双峰驼CYP1A酶体外孵育体系的最大反应速度为0.224 6nmol/(min·mg)±0.041 8nmol/(min·mg),米氏常数为5.577 9μmol/L±0.634 2μmol/L,内在代谢清除率为0.080 4(mL·min)/mg±0.023 1(mL·min)/mg。结果表明,本试验通过借助特异性探针药物动力学特征的研究,成功检测了双峰驼CYP1A酶的体外代谢活性。     

吉他霉素在猪体内的药代动力学特征及残留检测方法的研究

对7头健康猪按随机交叉设计经单剂量(2.5×104U/kg)内服吉他霉素原药及其微囊制剂进行了药代动力学试验。血浆样品经磷酸氢二钾溶液碱化、无水乙醚提取后,采用HPLC法测定血药浓度。结果表明,药时数据均符合一级吸收二室开放模型,主要药代动力学参数为:原药t1/2ka=0.23h±0.05h,t1/2β=6.43h±2.38h,tmax=0.65h±0.17h,Cmax=6.97μg/mL±1.40μg/mL,AUC=19.98mg/(L.h)±8.16mg/(L.h);微囊制剂t1/2ka=0.55h±0.16h,t1/2β=10.63h±3.73h,tmax=1.25h±0.23h,Cmax=7.97μg/mL±1.63μg/mL,AUC=36.24mg/(L.h)±6.15mg/(L.h)。吉他霉素原药在猪体内吸收较快,但其微囊制剂分布更广泛并消除较缓慢。对猪肌肉、肝和肾等添加吉他霉素标样后均采用0.2%偏磷酸-甲醇萃取后过SCX小柱用甲醇抽提吹干,脂肪加标样采用正己烷除脂后用甲醇反萃取减压蒸干。采用HPLC法测定组织浓度。结果,各组织在0.05～6.4μg/g范围内线性关系良好(r0.999),吉他霉素在各组织中回收率均大于65.38%,批内及批间变异系数分别小于5.56%和4.60%,检测限为0.05μg/g。结果表明,此方法重复性好、灵敏度高,可用于猪组织中吉他霉素残留的检测。     

二氟沙星在鸡体内的药物代谢动力学及生物利用度研究

将 30只艾维茵肉鸡随机分为 3组 ,进行了静脉注射、肌肉注射及内服二氟沙星的药物代谢动力学研究。血浆样品经甲醇沉淀血浆蛋白 ,高速离心 ,用反相高效液相色谱法测定鸡血浆中二氟沙星的浓度 ,MCPKP计算机程序处理血浆药物浓度 时间数据。结果 ,健康鸡静脉注射给药的药时数据适合二室开放模型 ,主要药物代谢动力学参数为 :t1/ 2α=0 .6 9h± 0 .4 3h ;t1/ 2 β=6 .11h± 1.5 0h ;V1=1.70L/kg±0 .33L/kg ;Vd(area) =3.10L/kg± 0 .6 7L/kg ;ClB=0 .37L/ (kg·h)±0 .10L/ (kg·h) ;AUC =2 9.16 μg/ (mL·h)± 8.0 4 μg/ (mL·h)。健康鸡肌肉注射及内服给药的药时数据适合一级吸收一室模型 ,前者的主要药物代谢动力学参数为 :t1/ 2Ka=0 .17h± 0 .12h ,t1/ 2Ke=5 .6 4h± 0 .74h ,tmax =0 .86h± 0 .4 0h ,Cmax =2 .5 1μg/mL± 0 .36 μg/mL ,AUC =2 2 .6 2μg/ (mL·h) ± 3.2 8μg/ (mL·h) ,F =77.0 %± 11.8% ;后者的药物代谢动力学参数为 :t1/ 2Ka=1.4 6h± 1.0 0h ,t1/ 2Ke=8.2 0h± 3.12h ,tmax=4 .34h± 2 .4 0h ,Cmax=1.0 0 μg/mL± 0 .2 1μg/mL ,AUC =15 .82 μg/ (mL·h) ± 3.6 7μg/ (mL·h) ,F =5 4.2 %± 12 .6 %。二氟沙星在健康鸡体内的主要药物代谢动力学特征为 :表观分布容积大