寄生牛环形泰勒焦虫裂殖体的淋巴细胞冻存液的研究

牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗,是我国血孢子虫免疫方面的第一个活虫苗,并已大面积应用于牛环形泰勒焦虫病流行区。我们于1977年试验成功了用液氮(-196℃)冻存含裂殖体牛淋巴细胞,为工厂化大量制苗提供了种子细胞,但种子细胞在液氮内冻存的过程中,也有程度不同的死亡,所以研究如何延长含裂殖体细胞苗的存活时间和提高种子细胞在掖氮中(-196℃)冻存后的存活率,是目前急待解决的问题。1985年我们曾用鱼鳞明胶和     

牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗免疫效果的观察

1985年3月,我们在陕西省的凤翔、雁塔、未央、韩城、旬邑、延安、蒲城等县(区)29个乡镇,7个奶牛场,102个村应用由中国农业科学院兰州兽医研究所和宁夏畜牧兽医研究所共同研制的牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗进行了免疫安全性试验和扩大试验,为推广应用本虫苗提供了资料。 (一)材料和方法 1.虫苗:为宁夏畜牧兽医研究所制造的第33、39代8534、8548等批号的牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗,置4℃冰箱或冰壶保存。注苗时,将本虫苗于40℃溶化、稀释,当日用完,一牛一针。对虫苗镜下计数:107万个活细胞/毫升细胞苗。     

含环形泰勒焦虫裂殖体细胞的转瓶培养效果

自从Tsur氏1945年用血浆凝块法培养环形泰勒焦虫感染牛的脾脏或淋巴结碎片,首次将环形泰勒焦虫裂殖体在体外培养成功后,Tsur氏和他的同事随后对培养方法不断加以改进,用膨酶消化单层细胞培养法代替了血浆凝块法,使裂殖体的人工培养前进了一大步,为近年来扁瓶静止培养法大量培养含裂殖体细胞打下了基础。由于动物细胞在玻瓶内培养要经过贴壁繁殖的过程,因此充分利用瓶壁面积,使细胞尽量多地得到贴壁机会,是提高细胞增     

脆弱艾美耳球虫、波氏艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫在培养细胞里的发育

在培养细胞里培养了鸡艾美耳球虫、波氏艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫,观察了它们的生长形态和培养条件。已获得的结果摘要如下。 (一)脆弱艾美耳球虫在用孢子体接种的细胞培养中发育成卵囊,波氏艾美耳球虫发育到成熟的第二代裂殖体。没有发现处于生长期的堆型艾美耳球虫。 (二)在培养脆弱艾美耳球虫第二世代裂殖体时,只有少数裂殖子侵入培养细胞,不过没观察到进一步的发育。 (三)裂殖体区分为三种形态学类型。第一种类型的裂殖体跟在活体里发现的形态一样。第二种类型裂殖体的细胞质分裂成大小不一的团块。每一团块包含一个或较多的细胞核。第三种类型裂殖体同细胞里的孢子体相似,尽管它们在量度上比后者明显大些。它们有一个折光体,一个大细胞核和丰满的细胞质。 (四)在裂殖子形成过程中看到三种不同的方法。裂殖子是由第一种类型的裂殖体,第二种类型裂殖体的球形体和第三种类型裂殖体的球状物的表面分裂而形成的。 (五)在试管里培养脆弱艾美耳球虫的最适条件在于应用鸡肾细胞和含有0.2％酵母浸出物的No.199培养基,并置40℃培养。当应用鸡胚成纤维细胞和把培养物保存在Eagle's最小必需量培养基里并在40℃孵育波氏艾美耳球虫时取得了满意的结果。     

环形泰勒虫裂殖体感染细胞培养技术的改进

在环形泰勒虫裂殖体胶冻细胞苗工厂化生产中,将小转瓶培养改为大转瓶培养,在此基础上又用成年健康黑白花牛血清代替犊牛血清,加犊牛血清的培养液收获细胞数为１４６ ．０ 万个／ ｍ Ｌ,而加成年牛血清的培养液在２ 次细胞培养中收获细胞数分别达１５３ ．８ 万个／ ｍ Ｌ 和１６２ ．０ 万个／ ｍ Ｌ。     

环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白的亚细胞定位分析

为研究微线体-棒状体蛋白在环形泰勒虫裂殖体及其在感染环形泰勒虫裂殖体的淋巴细胞中表达情况及亚细胞定位,应用Western-blot验证了该蛋白多克隆抗体的特异性;通过条件摸索找出最佳比例的固定剂和最佳一抗、二抗的工作浓度;利用优化好的条件对微线体-棒状体蛋白进行间接免疫荧光试验,用激光共聚焦技术确定该蛋白在环形泰勒虫裂殖体和其在感染的淋巴细胞中表达及亚细胞定位。结果表明,微线体-棒状体蛋白主要定位于环形泰勒虫裂殖体的表面,而在宿主淋巴细胞细胞质中分布较少。     

猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗保护剂的研究

自1988年我厂对冻干疫苗保护剂和冻干产品生产工艺进行了研究。以猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗为主进行了保护剂的筛选试验,找出一种保护剂配制方法、冻干曲线和时间及营养血清的配制等新工艺。用这种方法生产的猪瘟细胞的毒冻干苗在37℃环境中可保存10天,在22～25℃条件下可保存35天,0～4℃条件下可保护22个月,达到了国外同类苗的水平。     

牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t的体内扩繁试验

以被去除脾的昆明小白鼠为实验动物(40只),接种牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t,进行小鼠体内扩繁试验,并于接种后第8、12、24、48小时以及第3~10天每天经血液涂片检查接种后昆明小白鼠的红细胞染虫率,观察分析其扩繁情况;经昆明小白鼠心脏、眼球采血的方法收集其最高染虫率(15%以上)的血液内裂殖子,并进行冻存,摸索其保存、复苏条件等。结果显示,除脾术后昆明小白鼠均存活,检测其呼吸、脉搏、食欲、精神状态皆良好,说明摘脾手术成功;接种后第48小时可在昆明小白鼠血液里观察到裂殖子,第5~9天每组昆明小白鼠的平均染虫率可达15%~20%(最高峰),第10天后染虫率开始下降,血液涂片中裂殖子数量渐渐减少;经试验发现,在雌雄性昆明小白鼠体内的染虫率差异极显著(P=0.0070.01),去脾昆明小白鼠与未去脾昆明小白鼠的染虫率差异也极显著(P=0.000 20.01),牛源环形泰勒虫在除脾的昆明小白鼠血液内能被置换、增殖。染虫率为15%以上时昆明小白鼠血液里的裂殖子可用冷冻(-80℃)保存,亦可制作玻片裂殖子抗原备用,保存半年以内的裂殖子复苏活性最佳。该试验数据可为建立环形泰勒虫动物模型、教学、科研提供丰富的血液原虫株资源。     

环形泰勒焦虫(Theileria annulata)裂殖体细胞培养的研究

牛环形泰勒焦虫病为我国北方地区危害较大的一种血液寄生虫病,裂殖体(Schizont)或柯霍氏小体(Kochs bodies)是泰勒焦虫在网状内皮系统发育阶段的一种形态,主要寄生在肝脏,脾脏和淋巴结的网状细胞和成淋巴细胞内,具有很强的病原性和免疫原性。目前,通过细胞培养的方法,已能使裂殖体连续不断地在体外繁殖。     

牛环形泰勒焦虫同牛瑟氏泰勒焦虫交叉免疫的研究

近年来,我国研制成功的牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗,用其作为抗原物质,注射易感牛体后,可刺激有机体产生抗环形泰勒焦虫病的保护性抗体,并能有效地预防牛环形泰勒焦虫病。这已经通过试验和在生产中大批推广应用后,取得明显免疫效果而证实,然而这种具有特异性的免疫反应和保护效能,仅在预防环形泰勒焦虫病中发挥着应有的作用。但对于免疫泰勒属中的其他种(牛瑟氏泰勒焦虫)能否起到良好的安全保护作用,目前在国内外尚未见报道。因此我们考虑在家畜原虫学的免疫中,在同属异种中通过一种虫苗,能在同     

受小泰勒焦虫感染的牛成淋巴细胞培养的生长特性

曾从用东海岸热的病原小泰勒焦虫人工和自然感染的牛的脾脏培养其细胞。这些在形态上认证为成淋巴细胞的细胞是在悬浮培养中连续培养的。几乎每个细胞都受到无性裂殖体的侵袭。采自未感染牛的脾脏的培养则形成淋巴细胞,它们在悬浮培养中繁殖有限。     

急性犬瘟热伴发寄生性肠炎的病理形态学观察

为从病理学方面调查急性犬瘟热与寄生性肠炎的关系,通过免疫组织化学、苏木精伊红和过碘酸雪夫氏染色等方法,对12例急性犬瘟热伴发腹泻的病例进行了病理组织学研究。结果表明,6例腹泻主要是由球虫引起的,2例由隐孢子虫所致。犬球虫主要存在于病犬的空肠和回肠黏膜的上皮细胞内,在脱落的肠上皮细胞和被破坏的肠绒毛所形成的黏液内,也能检出大量的球虫。最常见的球虫形态为滋养体和裂殖体,滋养体多位于上皮细胞内或细胞间,断面呈不整圆形,核位于中央,被苏木精深染,原生质淡染呈细网状,质膜明显;裂殖体多呈不整圆形,内有香蕉状的裂殖子,位于变性的肠上皮细胞内,含有较多的糖原颗粒,用过碘酸雪夫氏染色时呈红色。隐孢子虫主要位于肠上皮细胞和肠腺上皮细胞的纹状缘,引起微绒毛破坏和细胞脱落。用抗犬瘟热病毒核衣壳蛋白单抗染色检查,小肠黏膜上皮细胞、隐窝的腺上皮细胞、浸润在肠黏膜固有层的淋巴细胞、巨噬细胞和集合淋巴结的树突状细胞均呈强阳性反应。据此认为急性犬瘟热的寄生性腹泻是在犬瘟热病毒引起肠黏膜抵抗力降低的基础上发生的。     

试验性羊泰勒虫病的病理学观察

对用羊泰勒虫单一种人工感染的试验羊进行了病理学观察。结果显示 ,试验羊的可视黏膜苍白 ,皮下脂肪胶样水肿 ,全身淋巴结、心、肝、脾、肺和肾均有不同程度肿胀 ;实质器官组织变化的主要特征为明显的增生和巨细胞结节形成 ;淋巴结的窦内皮与网状细胞明显增生 ,甚至形成团块和条索 ;淋巴与网状内皮细胞中可见到裂殖体 ;脾还可见到坏死结节 ;肾小球毛细血管内皮细胞和间质细胞也明显增生 ;肝窦内皮的增生特别明显 ,甚至形成细胞条索 ;与淋巴结、脾、肾一样 ,肝小叶内同样有巨细胞结节形成 ,在上述巨细胞结节中均可在细胞浆中发现裂殖体 ;大脑中主要表现血管内皮与小胶质细胞增生。     

柔嫩艾美耳球虫穿孔素样蛋白基因的原核表达与亚细胞定位

为了研究柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)穿孔素样蛋白(Et PLP)在球虫感染中与宿主相互作用关系,首次成功获得EtPLP1(1 932 bp)和EtPLP2(4 215 bp)2个目的基因。通过表达纯化得到2个大小分别为37和67ku的目的蛋白,Western-blot结果显示其反应原性良好。通过免疫荧光技术,观察到EtPLP1定位在子孢子顶端。m RNA转录水平检测结果显示,EtPLP1在子孢子阶段的表达量最高,其次是第1代裂殖子阶段,EtPLP2m RNA水平在第1代裂殖子阶段表达量最高,其次是第2代裂殖子阶段;它们在其他阶段表达量极低或不表达。结果表明EtPLP1和EtPLP2可能参与虫体入侵与逸出宿主细胞,为EtPLPs蛋白功能研究奠定了基础。     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的纯化试验

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的纯化试验１）秦建华赵月兰张明勇２）（张家口农业高等专科学校０７５１３１）球虫的裂殖子是进行球虫生理生化、体外培养及免疫学研究的基础材料。裂殖子存在于感染鸡的肠道内，为了提取和纯化裂殖子我们进行了如下试验。１材料与方法１...     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——疫苗试制、检验、保存及区域试验

自1981年初开展猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究以来,先后完成了一系列基础实验。在1983年试制第1批牛肾细胞苗的基础上,又重复试生产6批苗,经效检,均合乎标准。现将疫苗试制、检验、保存及区域试验结果报告如后。材料与方法(一)种毒 系农业部成都药械厂提供的480代冻干毒和F505代兔脾毒(湿毒),经本室复壮,选择定型热兔脾脏作为种毒,要求毒价不低于2×10~(-5)ID/ml。也可选用5万倍合格的细胞毒做种毒,脾毒和细胞毒以新鲜者为佳。     

幼年牦牛松果体的光镜和电镜观察

利用光镜和电镜技术对幼年牦牛松果体的组织形态结构特征进行了研究。结果表明,光镜下,幼年牦牛松果体由松果体细胞、少量的神经胶质细胞、毛细血管和神经等组成。电镜下,松果体细胞的电子致密度低,细胞质内含有丰富的线粒体、粗面内质网、滑面内质网、高尔基复合体、微管、微丝和核糖体,典型异质细胞器突触带呈球形,多位于质膜附近。神经胶质细胞内的线粒体丰富,胞体突起呈球形膨大伸入到松果体细胞之间。松果体细胞以及神经胶质细胞间均存在突触和连接复合体。牦牛松果体内的毛细血管为连续型,远腹侧血管周围可见色素细胞。     

牛瑟氏泰勒焦虫和环形泰勒焦虫液氮保存试验

低温保存家畜寄生原虫,国外多有报道。关于环形泰勒焦虫(Theileria anulata)的低温保存,B.T.(1973)证实用液氮保存环形泰勒焦虫495天仍存活。等(1975)认为环形泰勒焦虫裂殖体,以10～15％的甘油作保护剂,用干冰先冷却到-70℃后入液氮,保存120天仍有活力。国内仅张中行等(1980)作了人工培养的环     

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸磷酸酶5表达的影响

建立地克珠利抗柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染鸡动物模型,收集获得E. tenella第2代裂殖子,通过PCR扩增E. tenella第2代裂殖子丝氨酸/苏氨酸磷酸酶5(serine/threonine protein phosphatase type 5,Et PP5)基因编码序列,构建pET-28a-Et PP5表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达融合蛋白,镍亲和层析柱法纯化表达蛋白并免疫BABL/c小鼠制备Et PP5抗血清。采用免疫荧光和Western-blot技术检测第2代裂殖子Et PP5蛋白的表达。结果显示,30℃时,用1 mmol/L的IPTG诱导pET-28a-Et PP5表达的融合蛋白大多以包涵体形式存在。Et PP5主要分布在E. tenella第2代裂殖子的细胞质中,细胞核也有少量分布。经地克珠利处理后,E. tenella第2代裂殖子Et PP5蛋白表达降低了47.65%(P0.01)。提示,地克珠利可能通过作用Et PP5发挥抗球虫作用,这为地克珠利抗球虫作用机理的阐述提供了理论依据。     

家畜常见寄生性原虫体外培养的研究概况

当前,组织培养技术作为一种新的研究手段已应用于家畜寄生虫病的研究领域,尤其在原虫病的研究中起到了积极的作用。 自Gavribov等(1938)报道了乌疟原虫(plasmodium capisfrauni)红外期体外培养以来,Tsur(1945)进行了牛环形泰勒焦虫(Theileria annulata)裂殖体在离体组织中生长繁殖的研究。Hulliger等(1964)用分散细胞单层来大量繁殖Tannulata裂殖体。patton(1965)在初代牛肾细胞上观察了脆弱艾美尔球虫(Eimeria tenella)无性期的发育。Dorna(1970)在细胞培养中观察到了鸡球虫完整的生活史。然而组织培养中原虫的培