少孢节丛孢菌胞外蛋白酶的诱导与生化性质

应用不同诱导剂和不同营养组成的液体培养基诱导培养捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌产生发酵液,经浓缩处理后,对发酵液中的蛋白质含量、酶活性以及相关的生化性质进行了测定。结果表明,培养基的组成成分和相关诱导剂能够显著影响少孢节丛孢菌的代谢过程;而且秀丽新杆线虫刺激少孢节丛孢菌产生的培养基滤液和氨基酸刺激所产生的发酵液内含成分不同;蛋白酶活性越高的滤液中,磷酸酶活性越低;产生胞外蛋白酶的最佳培养时间为6d。     

捕食性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白质的生化性质研究

为纯化捕食性真菌Duddingtonia flagrans分泌的胞外蛋白酶并研究其生化性质,利用枸橼酸液体培养基对D.flagrans进行培养,以灭菌的马圆线虫进行诱导,之后用盐析法粗提培养液,再使用Sephadex G-100分子筛进行层析纯化,最后对纯化物进行最适pH、温度及蛋白酶抑制剂的抑制试验。结果显示,被纯化出的3种胞外蛋白酶的分子质量分别为38、63、19ku;在pH 6.0~7.0、45~55℃条件下,其活性最高;它们都对酶抑制剂菲罗啉和抑肽素非常敏感,其中38ku的蛋白酶对抑制剂PMSF也很敏感。上述结果为进一步研究捕食性真菌分泌的胞外蛋白酶在杀线虫过程中的作用以及今后在生产中的具体应用提供了重要参考依据。     

嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶对斑点叉尾鮰的组织病理学影响

采用硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A50凝胶层析等方法从嗜麦芽寡养单胞菌胞外产物中提纯了一种蛋白酶,将提纯的蛋白酶腹腔注射斑点叉尾鮰,研究了嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶对斑点叉尾鮰的致病性以及引起的病理变化。结果发现,斑点叉尾鮰出现不同程度的死亡,其LD50为3.49μg/g。病鱼鳃丝肿胀;肝及肾肿大,质地脆,有大小不等的坏死区;脾肿大出血。组织学观察可见肝细胞肿胀,严重者空泡变性,大量细胞坏死、溶解消失;肾小管上皮细胞严重空泡变性,细胞淡染,逐渐溶解、消失,隐约可见细胞轮廓;脾严重出血,网状内皮细胞坏死;胃肠黏膜下层炎性水肿。超微病理学观察发现肝细胞糖原颗粒减少,细胞核染色质溶解,线粒体肿胀,线粒体嵴模糊不清;脾大量红细胞浸润,网状内皮细胞核染色质大量消失;肾小管上皮细胞刷状缘微绒毛肿胀,脱落;细胞核染色质减少,边移,核膜扩张;线粒体肿胀,滑面内质网扩张。扫描电镜观察发现胃肠道黏膜上皮细胞肿胀、坏死、脱落。证实,嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶可致斑点叉尾鮰各组织器官出现不同程度的病理变化,特别是对肝、脾、肾、脑和胃肠道的影响较大。     

外寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展

外寄生虫对人类以及动物的致病作用包括直接和间接两方面,如吸血、引起过敏、组织损伤和传播病原体等,因此具有重要的公共卫生意义.为了能够更好的防治外寄生,有必要从分子水平了解其重要的生理活动.serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂是一种多功能分子,在生物体中广泛分布,在寄生虫-宿主-病原体相互作用中发挥着重要作用,主要参与吸血、...     

捕食性真菌Duddingtonia flagrans线虫诱导发酵液的蛋白质组学分析

捕食性真菌Duddingtonia flagrans杀虫机理是近年来生物防制领域的热点,而对其发酵液中的蛋白质组进行深入分析和研究,有利于揭示D.flagrans杀线虫的生化机制。本研究首次采用基于液质联用的蛋白质组学非标记定量(label free)技术,对线虫幼虫诱导下的D.flagrans发酵液与普通营养菌丝发酵液进行了大规模蛋白质表达相对定量分析。结果,共鉴定出蛋白质258个,其中46个为显著差异表达蛋白质。进一步对差异蛋白质进行GO注释,结果表明,经线虫幼虫诱导的D.flagrans发酵液中差异蛋白参与的蛋白功能和生物学过程更加多样,以催化和结合功能为主,同时还参与感知环境刺激、信号转导、过氧化活性及胞壁合成等过程。进一步分析表明,与对照组相比,过氧化氢酶和三羧酸循环中柠檬酸甲酯合酶前体上调表达加快了有氧呼吸,推测D.flagrans分泌胞外蛋白酶还需要氧化应激。此外,丝氨酸酶与酪氨酸酶前体显著差异表达,可能该类酶是D.flagrans侵染线虫的重要毒力因子。KEGG代谢通路分析表明,差异蛋白还主要参与了糖、脂质和氨基酸等初级产物以及次级代谢物的合成与代谢过程。通过对差异蛋白质组的深入解析和研究,有利于揭示D.flagrans对线虫的作用机理,为应用D.flagrans对线虫生物防控提供了强有力的支撑。     

胞内劳森菌实时荧光RPA方法的建立及初步应用

本研究基于胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)16S rRNA基因保守序列,设计特异性引物和exo探针,建立了一种能够快速检测胞内劳森菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增方法(real-time RPA)。进一步对real-time RPA方法的特异性和灵敏性进行了分析,对临床疑似病例的猪粪便和回肠样品进行了检测,并同real-time LAMP和real-time PCR检测结果进行了比较。结果表明,该方法能够在39℃等温条件下,20 min内实现对胞内劳森菌的有效检测;所建立的方法特异性强,仅对L.intracellularis产生特异性扩增,对其他常见引起猪腹泻的病原均无扩增;灵敏性高,以L.intracellularis基因组DNA为模板,检出限为1.4×10~2fg/μL;在60份临床样品中,该方法对L.intracellularis的检出率为66.7%(40/60),同real-time LAMP和real-time PCR方法一致。本研究所建立的real-time RPA方法反应快速、特异性强、灵敏性高,可用于猪场胞内劳森菌的快速检测。     

猪链球菌2型39ku胞壁蛋白诱导巨噬细胞凋亡的研究

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)的39ku胞壁蛋白对巨噬细胞的致病作用,将39ku胞壁蛋白纯化,取小鼠腹腔巨噬细胞(murine peritoneal macrophage,MPM)和39ku胞壁蛋白(4μg/mL和40μg/mL)共孵育,用荧光显微镜观察细胞的形态学变化,以不同浓度(4～50μg/mL)39ku胞壁蛋白腹腔注射小鼠,作用6h,用DNA Ladder法检测MPM凋亡情况,以40μg/mL腹腔注射,分别作用2、4、6、8h,用流式细胞术检测MPM凋亡率,同时用试剂盒比色法检测其Caspase 3的表达动态。结果显示,低浓度(4μg/mL)诱导后MPM未见异常形态改变;而高浓度(40μg/mL)能引起典型的凋亡形态学变化,低浓度(4μg/mL)诱导后,DNA图谱与阴性对照相同;而高浓度(20～50μg/mL)诱导后均出现典型的DNALadder,且随39ku胞壁蛋白浓度增加,梯状条带更加清晰。流式细胞分析表明,MPM的凋亡率随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而增加,与对照组之间均差异极显著(P<0.01);Caspase 3的表达量随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而上升,各时间点之间均差异显著(P<0.05)。结果表明,39ku胞壁蛋白可以诱导MPM高水平凋亡,凋亡率与39ku胞壁蛋白的作用浓度和时间之间正相关,39ku胞壁蛋白可单独作为SS2的毒力因子。     

以CotB作为融合基序在枯草芽胞杆菌芽胞表面展示雏沙门菌OmpC的研究

本文旨在通过使用枯草芽胞杆菌芽胞衣壳蛋白CotB作为融合基序,构建表面展示雏沙门菌外膜蛋白OmpC的重组芽胞,为防控沙门菌感染提供新的思路。分别PCR扩增雏沙门菌OmpC编码基因与含自身启动子的芽胞衣壳蛋白CotB编码基因,以质粒pDG364为基础进行两者融合并构建整合型重组质粒pDG364-cotB-ompC,将融合基因整合于枯草芽胞杆菌168 amyE基因位点,通过淀粉酶活性、PCR技术、免疫荧光显微镜进行分析。结果显示,以芽胞衣壳蛋白CotB为融合基序,成功构建获得了携带cotB-ompC融合基因的整合型重组质粒pDG364-cotB-ompC,并经同源双交叉重组将其整合于枯草芽胞杆菌168基因组上;淀粉酶活性分析与PCR鉴定表明,该融合基因被成功整合于amyE基因位点,使用OmpC特异性抗体探测的免疫荧光显微镜分析检测到特异性的荧光信号。结果表明,雏沙门菌OmpC以具有生物活性的形式被成功表达并展示于枯草芽胞杆菌168的芽胞表面。     

一株铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究

为控制铜绿假单胞菌的感染或污染提供生物制剂,分离到1株新的铜绿假单胞菌噬菌体,并研究其生物学特性。以铜绿假单胞菌为宿主细菌,从山西太谷某养鸡场的污水粪便混合物中分离出噬菌体。采用双层琼脂法对该噬菌体进行了分离和表征鉴定,用透射电镜（TEM）观察噬菌体的形态和大小,同时测定了噬菌体滴度、感染复数（MOI）、体外抑菌活性、一步生长曲线、温度、pH和氯仿稳定性。提取分离的噬菌体DNA,通过测序方法进行序列分析。结果显示,本研究分离出1株铜绿假单胞菌的烈性噬菌体,透射电镜显示该噬菌体属于肌病毒科,命名为v B＿PaeM＿TG2。噬菌斑大小为1～2 mm,最佳MOI为0.1,潜伏期约为10 min,暴发期约为30 min。v B＿PaeM＿TG2对温度、氯仿和pH具有良好的耐受性。v B＿PaeM＿TG2是双链环状DNA,基因组大小为206 910 bp,平均GC含量为62.07%,预测有387个开放阅读框。结果表明,分离的铜绿假单胞菌噬菌体v B＿PaeM＿TG2潜伏期较短,裂解能力强,在高温、高氯仿浓度和宽pH范围下比较稳定。本研究为铜绿假单胞杆菌病的防治提供了新的理论支持。     

华南虎源铜绿假单胞菌的分离鉴定及其生物学特性研究

为探明福建省梅花山华南虎繁育研究所1只3岁华南虎公虎的死亡原因,无菌采集死亡虎的肝、脾、肺等组织样本,并接种于鲜血琼脂培养基分离优势细菌,利用表型特性及16S rRNA基因序列分析鉴定分离菌株;通过毒力基因检测、小鼠致病性试验、药敏试验及耐药基因检测对分离菌株进行致病性和耐药性研究。结果显示,从死亡华南虎肝组织中分离到1株铜绿假单胞菌,命名为FJ/Tiger-201801;该分离菌与26株铜绿假单胞菌16SrRNA的核苷酸序列同源性为97.1%～99.6%,其中与水貂源CS-20株、林麝源FMDP002株、人源Kasamber2株的同源性高达99.6%;毒力基因检测结果显示,该分离菌携带exoT、exoS、exoY这3种毒力基因;动物致病性试验结果显示,该分离菌对小鼠具有较强的致病性,试验小鼠在攻毒后13 h内全部死亡,并对死亡小鼠的肝、肺、脾等组织器官造成了严重的病理组织损伤;对11类30种常用抗菌药物的药敏试验结果显示,该分离菌株对氨苄西林等其中8类18种抗菌药物均表现耐药,对多黏菌素B等6种抗菌药物表现中度敏感,仅对头孢吡肟、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素和哌拉西林这6...     

水貂出血性肺炎病原铜绿假单胞菌的分子特征

为了解水貂出血性肺炎病原铜绿假单胞菌的流行特点,对来自水貂出血性肺炎和貂场环境经生化培养鉴定的41株疑似铜绿假单胞菌分离株,用PCR快速鉴定;对鉴定的菌株以纤毛、鞭毛结构蛋白基因的核苷酸序列进行分型,并进行LPS血清分型。结果显示,建立了快速鉴定铜绿假单胞菌的二重PCR方法和纤毛、鞭毛结构蛋白基因序列的分型方法。菌株分型结果显示,分离的铜绿假单胞菌株被分为6种核酸分子型和6种血清型(G、B、I、C、D、F)。分型结果表明,水貂出血性肺炎的主要流行株属于LPS血清型G、核酸分子型4f4p或4f5p;另外,少数其他分子型铜绿假单胞菌也可对水貂致病。     

维氏气单胞菌胞外产物HisJ基因的克隆与生物信息学分析及原核表达

为研究维氏气单胞菌胞外产物HisJ基因的可能相关功能,扩增HisJ基因,并通过同源性比较构建HisJ基因的系统进化树,利用相关软件对HisJ基因编码的蛋白进行生物信息学分析,并对HisJ基因进行原核表达以及表达产物的免疫原性进行检测。结果显示,HisJ基因全长774 bp,编码247个氨基酸,TH0426株HisJ与维氏气单胞菌属同一分支,具有信号肽、跨膜区,属于膜外蛋白,二级结构主要以α螺旋、无规则卷曲为主。经SDS-PAGE分析发现,重组菌可表达出融合性蛋白,并且以10‰的体积接菌、IPTG终浓度为1.0mmol/L诱导8 h表达效果最好。Western-blot分析结果显示,重组HisJ蛋白在大肠杆菌中被成功表达且能被小鼠抗HisJ蛋白血清识别,表明表达的HisJ蛋白具有一定的免疫原性。为进一步对HisJ蛋白的结构功能及与致病性、耐药性关系的研究奠定了基础。     

捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白质的产生及其杀虫作用的研究

将捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans接入含有不同诱导物的LMZ培养基和枸橼酸液体培养基中,然后进行为期6d的培养并收集发酵液,进而测定其中蛋白质的质量浓度和蛋白酶活性及磷酸酶活性,并用发酵液进行杀虫试验。结果显示,动物寄生性线虫诱导的枸橼酸培养基发酵液中蛋白质的质量浓度最高可达381.4mg/mL,蛋白酶和磷酸酶比活性最高,分别为9.48U/mL±0.03U/mL和38.30U/L±0.04U/L,对线虫的致死率为50.11%±11.8%,均明显高于相应的对照组;同时发现,D.flagrans发酵液对蝇蛆的致死率最高,可达40.56%±0.13%。结果表明,在D.flagrans发酵液中含有杀虫物质。研究结果为以后研究捕食线虫性真菌的化学杀虫机理提供了重要依据。     

住肉孢子虫抗原的纯化及生化特性研究

住肉孢子虫抗原的纯化及生化特性研究１）胡庭俊段习文程富胜（中国农业科学院中兽医研究所兰州７３００５０）潘光武（中国农业科学院兰州兽医研究所）住肉孢子虫病是一种严重危害人畜健康的人畜共患原虫病。目前，在本病的诊断方面，免疫学诊断方法为唯一的生前诊断方法...     

铜绿假单胞菌flgE和oprL基因联合DNA疫苗的免疫效果

为测试铜绿假单胞菌flgE和oprL基因的联合DNA疫苗在小鼠体内的免疫效果,本试验分别构建铜绿假单胞菌flgE和oprL基因的DNA疫苗pflgE和pOPRL,并制备了联合DNA疫苗pflgE+pOPRL,同时设灭活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)空载体和PBS分别作为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,间接EL...     

正常猪转移因子的制备及某些性质的研究

转移因子(Transfer Factor,简称TF)是免疫活性淋巴细胞所释放的一种可透析性物质。该物质能将供体的某些细胞免疫功能,特异地转移给无或缺乏某种细胞免疫功能的受体。它是一种新型的免疫制剂,它的研究和应用对于目前用抗生素或免疫球蛋白无法控制的某些细胞内感染的病毒病、细菌性病、真菌性病和寄生虫病的防治,展示了新的途径。1979年以来,我国先后开展了应用猪转移因子(Transfer Factor of Swine,简称STF)治疗动     

实验性雏鸡缺锌症临床生化及组织病理学研究

本实验结果表明,实验D组(补加锌27.5ppm)发育正常,A组(基础日粮含锌21.5ppm,钙0.95％)为亚临床缺锌症。生化检查指出,缺锌鸡ALP和血清球蛋白明显降低,而血清钠和血红蛋白明显升高。组织病理学观察发现,肝、肾、脾和性腺均呈退行性变化,认为是本病主要病理特征。     

山东省山羊“猝死症”病原和防治方法的研究——肺炎克雷伯氏菌和凝结芽胞菌的致病性和免疫原性试验

用从山东省菏泽地区的山羊“猝死症”病料中分离出的肺炎克雷伯氏菌和凝结芽胞菌做致病性试验证明，肺炎克雷伯氏菌对小鼠的致死量约为１．７亿个活菌，对山羊的致死量约为１７０亿个活菌；凝结芽胞菌对小鼠的致死量为０．５５亿个活菌，对山羊的致死量为１６５亿个活菌。免疫试验表明，肺炎克雷伯氏菌和凝结芽胞菌对小鼠和山羊均有较好的免疫原性。用肺炎克雷伯氏菌和凝结芽胞菌制成的混合苗以５ｍｌ和８ｍｌ的剂量免疫山羊，２１ｄ后用以上２种菌的致死量攻击，均获得完全保护     

乳酸杆菌活的非可培养状态诱导条件的筛选与荧光观察

依据逆向调整原则,设计了4套诱导乳酸杆菌进入活的非可培养(VBNC)状态的方案,同时应用LIVE/DEAD细胞染色试剂,对进入该状态的细菌进行了荧光观察,并尝试用Tween-80对VBNC状态细菌进行了复苏.结果显示,MRS液体培养基,pH 2.0～3.0,4℃,兼性厌氧培养和不含半胱氨酸的MRS液体培养基,PH 2.0～3.0,4℃,兼性厌氧培养均可使3株试验菌体在短期内进入VBNC状态,并且能较长时间维持这一状态;3株细菌菌体均发生萎缩、弯曲,且彼此相连,原本单在的杆菌变成了链杆菌;随着诱导时间的延长,菌体的交联程度明显增加,出现众多红绿交替的长链杆菌;Tween-80可使VBNC状态细菌恢复为可培养状态并实现复苏,而复苏后的细菌重新具备原菌的形态和生化特征.表明,乳酸杆菌具有VBNC状态,并且在此状态下呈现与正常菌体不同的形态特征.     

松鼠猴源沙门菌的分离鉴定及生物学特性研究

从扬州某动物园病死松鼠猴的病料中分离出疑似沙门菌株,经革兰氏染色镜检、生化试验、PCR扩增沙门菌invA基因和血清型鉴定,再对该菌株的生物学特点如致病性、生物被膜形成能力和药物敏感性进行研究。结果表明,从送检猴肝中分离出的菌株,革兰氏染色为阴性短杆菌;能够发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等,不能发酵乳糖和蔗糖,V-P反应阴性,MR阳性;PCR检测inv A基因为阳性,确认分离菌为沙门菌;血清型鉴定为鼠伤寒沙门菌。致病性试验采用灌胃方式攻毒小鼠,18 h后小鼠死亡。生物被膜检测结果表明,该分离菌株有较强的生物被膜形成能力。药敏结果显示,分离菌对头孢噻肟、头孢哌酮和卡那霉素等敏感,对庆大霉素、链霉素和复方新诺明耐药。