牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为确定黑龙江省2个规模化奶牛场犊牛急性呼吸道感染的病因,笔者进行了病原的分离纯化,细菌16S rDNA基因和多杀性巴氏杆菌特异性基因OmpH鉴定、生化试验、药敏试验、半数致死量试验、荚膜血清型分型及22种毒力因子的检测,以确定主要病原的种类、型别及生物学特性。结果表明,从死亡牛肺和患病牛鼻拭子分离的2株病原菌均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,分别被命名为WC16551和LY01,序列分析结果表明,其与牛源多杀性巴氏杆菌同源性达到99%以上。药敏试验显示2株菌均对恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。半数致死量结果表明,LY01菌株的毒力明显强于WC16551菌株,2株分离菌均携带19种毒力因子,未检出hgbB、toxA和nanB三种基因。上述研究结果表明,导致2个牛场发病的主要病原菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。     

猴源宋内氏志贺菌的分离鉴定及生物学特性分析

从四川省某规模化猕猴养殖基地的病死猕猴的脏器及肠道内容物中分离到1株可疑菌,对其纯化培养、革兰染色和生化鉴定后进行了分子水平鉴定,包括ipa H基因和wzy基因测定、16S r RNA基因序列分析,并进行了致病性分析及药敏试验。结果显示,该分离菌符合宋内氏志贺菌生物学及分子学特性,对小鼠具有较强致病性。16S r RNA基因多序列比对,绘制遗传距离及遗传发育树,证明其与2株宋内氏志贺菌(CP010829.1和HE616528.1)遗传距离最小,均为0.001。药敏试验显示,该菌株对头孢类等4类药物敏感,对青霉素类等6类药物耐药。结果表明,该分离株为宋内氏志贺菌且具有较强的致病性和耐药性。     

禽致病性大肠杆菌血清型、进化分群及毒力基因的分子流行病学调查

为了解禽致病性大肠杆菌(APEC)的分子流行特点,从华东等地区分离鉴定210株APEC菌株,然后检测其血清型、系统进化分群及毒力基因,并分析毒力因子与血清型、系统进化分群之间的关联性。血清型检测结果显示,O78、O1、O2为流行血清型。通过系统进化分群分析发现A、B1、B2及D群比例分别为21.90%、20.00%、31.90%、21.90%。毒力基因检测结果显示,fimC、mat及ibeB基因检出率为90%以上,papC、neuC、vat、ibeA检出率低于22%,且所有分离株至少含有4个毒力基因。关联分析发现,毒力基因irp2、ibeA、neuC、vat及ETT2在特定血清型中的分布较高,而papC、tsh、irp2、neuC、vat及ibeA在B2进化分群较高。结果表明,华东等地区APEC携带多种毒力基因,毒力基因分布与特定血清型及系统进化分群具有关联性,为了解当地的APEC优势流行菌株及防控提供了参考。     

狐貉貂源致病性大肠杆菌的分离与鉴定

为了解引起狐、貉、貂流产的致病性大肠杆菌的血清型与毒力基因的流行情况,无菌采集流产仔兽或母兽的阴道分泌物进行病原的分离培养,经细菌形态观察、培养特性试验、生化试验鉴定出了4株致病性大肠杆菌。采用玻片凝集法测定了大肠杆菌病有关的血清型分布,用PCR检测9种毒力相关基因。定型菌株2株,分别属于2个不同的血清型(O107、O38)。9种毒力基因的PCR检测结果表明,ler、irp2、iutA、fyuA、astA、papC基因的检出率分别为100%、75.0%、50.0%、50.0%、50.0%、50.0%。同时携带ler、irp2、fyuA、iutA和papC基因的菌株致病性最强,该类菌对毛皮动物健康具有潜在威胁,应引起高度重视。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

取病死鸡肝接种于血清琼脂平板,挑取符合巴氏杆菌特征的单菌落进行纯化培养和染色镜检;对纯培养菌提取核酸,进行16S r RNA、kmt1和cap A基因的PCR鉴定,7个管家基因的PCR扩增和多位点序列分型,以及12个毒力基因的PCR检测;并进行分离菌的动物回归试验。结果显示,分离的2株病原菌(HN-1和CZ-6)均为两极浓染的革兰阴性短杆菌,16S r RNA和kmt1基因序列与多杀性巴氏杆菌的同源性均高于99%,荚膜血清型鉴定为A型,基因型为ST129型,除tox A、ptf A、nan H之外的9个毒力基因均被检出,动物回归试验表明分离菌对鸡的致病性较强。结果表明,这2株鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定为我国禽源菌株的遗传特性研究提供了一定参考。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及其生物学特性的研究

为了对疑似猪接触传染性胸膜肺炎的病死猪肺脏进行胸膜肺炎放线杆菌(APP)的分离鉴定,并研究其生物学特性,通过形态学及培养特性观察、生化试验、PCR方法对分离菌株进行了鉴定,并对APP分离株进行了NAD依赖试验生物学分型、PCR方法血清学分型、PFGE基因分型以及K-B纸片法药敏试验。结果显示,共分离到16株APP,源自两省三地的APP分离株具有一致的形态学特征和相似的生化特性。9株福建分离菌均为生物Ⅱ型,其PFGE基因型均为Pa4;7株安徽分离菌均为生物I型,其中6株为血清型12型,菌株FD1402的PFGE基因型为Pa2,其余5株APP菌株的PFGE基因型为Pa1,剩余1株为血清型3型,其PFGE基因型为Pa3。药敏试验结果显示,对18种常用抗菌药中的环丙沙星、诺氟沙星、氟苯尼考,安徽株均100%敏感,福建株依次为88.9%、77.8%和66.7%敏感;所有分离株对其他15种药物均表现出不同程度的耐药。上述结果表明,不同来源APP菌株的生物学特性较为一致。血清型12型是安徽省APP的主要流行血清型之一。APP分离株的PFGE基因型与血清型、生物型之间无明显的相关性。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2014年3月至2015年2月从来源于全国15个省份的180份临床猪肺组织样品中共分离到71株多杀性巴氏杆菌,分离率为39.4%。利用PCR技术对所分离的多杀性巴氏杆菌进行荚膜血清型鉴定,其中A型菌株41株(占57.8%),D型菌株27株(占38.0%),F型菌株3株(占4.2%),71株多杀性巴氏杆菌中包括1株D型产毒素多杀性巴氏杆菌(占1.4%),说明当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A型和D型菌株。应用PCR检测多杀性巴氏杆菌23种毒力基因,结果显示:多杀性巴氏杆菌毒力基因的数量大多分布在15~19之间,平均携带个数为17.5个;23种毒力基因中,ptfA,fimA,hsf-2,sodA,sodC,ompA,ompH,oma87,plpB,exbB,tonB,Fur,hgbB的检出率在90%以上,而toxA基因的检出率极低(1.4%),并且在猪源多杀性巴氏杆菌中未检测到t bpA的存在;分析毒力基因在不同血清型菌株中的携带及分布情况发现,A型的平均毒力基因携带数为18.2个,D型为16.4个;不同毒力基因在不同血清型的多杀性巴氏杆菌中的分布也存在一定的差异,其中唾液酸代谢酶基因nanB、透明质酸酶基因pmHAS及黏附基因tadD和pfhA在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率高于其在D型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01);而黏附基因hsf-1在D型多杀性巴氏杆菌的检出率显著高于其在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01)。对所分离菌株的16SrRNA基因进行测序,并与NCBI上公布的10株多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因进行进化树分析,结果显示:71株多杀性巴氏杆菌主要分为2个亚群,亚群Ⅰ和HB03及3480的亲缘关系较近,而亚群Ⅱ则与HN06、Pm70、36950等菌株的亲缘关系较近;遗传进化的结果说明,多杀性巴氏杆菌的亲缘关系与其来源、血清型及其导致的疾病种类并没有表现出特定的亲缘关系。     

贵州某猪场胸膜肺炎放线杆菌血清5型的分离鉴定

2020年11月贵州毕节某猪场一头经产母猪突然发病死亡,为鉴定导致其发病死亡的致病菌,试验无菌采取病死猪病变肺组织,通过细菌分离培养、染色镜检、生化试验、16S rRNA PCR扩增等方法进行鉴定,并对分离菌进行药敏试验、血清型鉴定、毒素基因鉴定、耐药基因检测及毒力试验。结果显示,从病变肺中分离到1株病原菌,分离菌的菌落形态、菌体形态、生化特征和16S rRNA基因序列均与胸膜肺炎放线杆菌相符,将其命名为APP GZBJ2020;药敏试验显示,APP GZBJ2020株对头孢曲松、头孢哌酮、青霉素等9种药物敏感,对头孢氨苄和米诺环素中度敏感,对庆大霉素、红霉素、新霉素等9种药物耐药;血清型鉴定结果显示其为血清5型胸膜肺炎放线杆菌;毒素鉴定结果显示APP GZBJ2020株含有ApxⅠ、ApxⅡ及ApxⅣ三种毒素基因;耐药基因检测结果显示,APP GZBJ2020株携带有tem、gyrB、parC和parE四种耐药基因;动物毒力试验结果显示,APP GZBJ2020株对小鼠有致病性。试验成功从病死经产母猪病变肺中分离到1株血清5型胸膜肺炎放线杆菌,试验结果可为该猪场治疗发病猪提供一定帮助,并为了解胸膜肺炎放线杆菌在贵州省的流行血清型提供数据支持。     

广东省发病猪禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分布

为了解广东省发病猪、禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛(HPI)的分布和HPI阳性菌的血清型,从广东省发病的猪、禽养殖场共分离鉴定了608株大肠杆菌,针对耶尔森菌强毒力岛的标志基因irp2基因设计1对引物,对这些大肠杆菌进行了irp2基因的PCR检测;并对HPI阳性菌进行O血清型鉴定。结果显示,有105株菌含有irp2基因,即HPI阳性率为17.27%(105/608)。猪源、鹅源、鸽源、鸡源、鸭源、鹧鸪源大肠杆菌的HPI检出率分别是16.51%、17.81%、21.05%、17.74%、19.01%及0;105株HPI阳性菌的血清型分布较为分散,没有明显规律;主要的血清型有O1、O26、O45、O114、O136、O18等。研究表明,广东省猪、禽养殖场大肠杆菌的HPI携带率较高,血清型复杂。     

猕猴肠侵袭型大肠杆菌的分离鉴定及其毒力因子基因的检测

2010年5月从四川省某猕猴养殖场急性腹泻猕猴肠道内分离出4株致病性大肠杆菌,并对其进行了16SrDNA扩增、生化反应、血清型鉴定、药敏试验以及毒力因子基因的分子生物学检测。结果显示,该菌株血清型为O28;药敏试验证实该菌对多种抗生素具有抗性,并且呈现多重耐药性;攻毒试验证实该菌能够导致小白鼠大量死亡;多重PCR成功检测出侵袭性大肠杆菌的Einv毒力基因。确定该病原菌为肠侵袭型大肠杆菌,而且毒力很强。     

四川部分区域鸽源沙门菌携带情况的调查及其部分生物学特性的分析

为了解四川部分区域鸽源沙门菌的病原携带情况及分离菌的部分生物学特性,笔者采用RTPCR对四川部分区域采集的1 375羽赛鸽、信鸽的肛门拭子、粪便样本开展了沙门菌携带情况的调查,检测分离鉴定得到的沙门菌部分毒力基因。结果鉴定出52株沙门菌,检出率为3.85%(95%置信区间为2.81%～4.85%),以双流区、郫都检出率较高,分别为11.23%(9/81)和11.11%(10/89),各区域间检出率差异极显著(P0.01)。甲型副伤寒沙门菌、纽波特沙门菌均占定型菌株的11.9%,定型菌毒力基因sipC占比为92.85%,提示分离株有较强的入侵非吞噬细胞的能力。结果丰富了鸽源沙门菌携带情况的相关资料,为鸽源沙门菌的深入研究及防控提供了参考。     

猪沙门菌分离株的毒力及耐药特征

为了检测哈尔滨市猪沙门菌分离株的毒力及耐药情况,对采自健康猪群的非重复35株沙门菌进行了血清型鉴定、人工感染及毒力试验、药敏试验、耐药基因的检测与转移试验。结果显示,检出的最主要血清型为猪霍乱沙门菌,共25株,占71.4%(25/35),其次为猪伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌。被攻毒小鼠全部死亡,肝、脾、胃出现不同程度的出血性病变。大部分沙门菌株对临床常用的抗菌药物已产生多重耐药,其中对氨苄青霉素、氟喹诺酮类、四环素和氨基糖苷类抗生素的耐药性较高,而碳青霉烯类抗生素的体外活性较高。结果表明,碳青霉烯类抗生素可作为临床治疗沙门菌病的首选药物之一。     

湖南省猪源粪肠球菌毒力基因的检测及部分表型的测定

采用PCR方法对湖南省分离的42株粪肠球菌的8种毒力相关的基因即溶血素基因cylA、明胶酶基因gelE、表面蛋白基因esp、胶原蛋白黏附素基因ace、聚集物质基因asa1、心内膜炎有关的抗原基因efaA以及2个假定毒力相关基因EF3314、EF0591进行了检测,并用平板法测定了这些分离株的溶血性和明胶溶解性。结果显示,24株粪肠球菌分离株普遍存在EF3314基因,检出率为100%;其次是efaA基因,检出率为92.9%;其他毒力基因gelE、ace、asa1、cylA、esp、EF0591的检出率为分别为88.1%、59.5%、52.4%、54.8%、38.1%、4.76%。菌株在绵羊血琼脂平板上以α溶血为主,而在家兔血琼脂平板中以β溶血为主,家兔血琼脂平板溶血的检出率(95.2%)高于绵羊血琼脂平板溶血的检出率(88.1%)。HN45菌株属于cylA基因阳性菌株却表现为不溶血,而19株cylA基因阴性菌株中只有YZ28菌株在家兔血琼脂平板上表现不溶血,HH57菌株在绵羊血琼脂平板上表现不溶血。5株gelE基因阴性分离株只有2株不分解明胶,37株gelE基因阳性分离株中,有32株分解明胶,5株gelE基因阳性菌株不能分解明胶。结果表明,这42株粪肠球菌中每株菌最少携带1个毒力因子基因,有些菌株最多携带7个毒力因子基因;菌株的溶血与明胶溶解的基因型和表现型并非完全一致。     

禽致病性大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分子流行病学调查

为了解耶尔森菌强毒力岛(HPI)在禽致病性大肠杆菌(APEC)中的流行情况,根据HPI结构基因irp2和fyuA参考序列设计了引物,用PCR方法和斑点杂交法对从江苏等地分离的APEC基因组进行了扩增和检测,并对E.coliNTJC040406菌株相关基因进行了克隆和序列分析。结果表明,216株APEC中有44.9%的菌株携带有HPI,序列分析表明相关基因与GenBank中参考序列的同源性高达98%以上。提示HPI在APEC中广泛存在,经进一步分析,发现分离菌株是否携带HPI与O78等特定血清型有一定的相关性。     

兔F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其致病性

对从山东某獭兔养殖场病死仔兔肺中分离的1株疑为巴氏杆菌菌株进行了菌落形态学观察及培养特性、革兰氏染色、生化反应、仔兔致病性回归试验、小鼠毒力试验,并采用PCR方法对该分离株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰氏染色阴性,生化试验及PCR鉴定结果显示为F型多杀性巴氏杆菌,能引起獭兔仔兔肺出血、坏死,并致部分仔兔死亡。表明该分离菌株为比较少见的兔F型多杀性巴氏杆菌。     

扬子鳄源变形杆菌的致病性测定及毒力因子鉴定

为确定人工养殖条件下越冬期间扬子鳄尿酸盐沉积的发病原因,对2012—2013年分离于发病扬子鳄或卵的18株普通变形杆菌(Proteus vulgaris)进行PCR鉴定、致病力试验、毒力因子检测。结果显示,18株普通变形杆菌中强毒株的小鼠LD50为2.5×106~5.3×106CFU/m L。采用特异性引物进行PCR,检测到18株菌的Fli L、Zap A、Hpm A、Hpm B、Rpo A毒力因子基因。鉴定出3株强毒性扬子鳄源普通变形杆菌,但并未发现毒力因子与菌株的毒力强弱有直接关系。本研究结果可为深入探究变形杆菌引发扬子鳄发生尿酸痛风并造成死亡的原因提供试验依据。     

松鼠猴源沙门菌的分离鉴定及生物学特性研究

从扬州某动物园病死松鼠猴的病料中分离出疑似沙门菌株,经革兰氏染色镜检、生化试验、PCR扩增沙门菌invA基因和血清型鉴定,再对该菌株的生物学特点如致病性、生物被膜形成能力和药物敏感性进行研究。结果表明,从送检猴肝中分离出的菌株,革兰氏染色为阴性短杆菌;能够发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等,不能发酵乳糖和蔗糖,V-P反应阴性,MR阳性;PCR检测inv A基因为阳性,确认分离菌为沙门菌;血清型鉴定为鼠伤寒沙门菌。致病性试验采用灌胃方式攻毒小鼠,18 h后小鼠死亡。生物被膜检测结果表明,该分离菌株有较强的生物被膜形成能力。药敏结果显示,分离菌对头孢噻肟、头孢哌酮和卡那霉素等敏感,对庆大霉素、链霉素和复方新诺明耐药。     

绵羊源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

为明确从新疆某绵羊养殖场送检的病死羊的致病菌,对病死羊的心脏、肝和肺组织采用细菌分离培养、形态观察、生化试验,纯化菌落进行种特异性和荚膜血清型PCR鉴定以及药敏试验、致病性试验和动物回归试验。为了解分离菌株的生物学特性及免疫原性,笔者以BALB/c小鼠为动物模型对分离株进行同源性和异源性的免疫攻毒保护试验。结果显示,在BHI琼脂培养基上长出灰色、光滑小菌落,革兰氏染色为红色的小短杆菌;分离株能发酵葡萄糖等,符合多杀性巴氏杆菌（Pm）的生化特性;PCR扩增出大小为460 bp的种特异性条带和1045 bp的荚膜血清A型特异性条带,Blast检索结果与Pm的同源性为99.7%。结果表明,分离菌为多杀性巴氏杆菌,属于荚膜血清A型。药敏试验显示,该菌株对头孢拉定、环丙沙星、替米考星等7种药物具有敏感性;该菌株能够引起实验小鼠和兔的发病死亡,根据羔羊的发病情况和临床检查表明,本菌为强致病性菌株;将分离株培养物研制成不同佐剂的灭活疫苗探究其免疫效果,氢氧化铝佐剂灭活疫苗可以抵抗同源菌的攻击,保护率能够达到100%;对异源血清型Pm免疫攻毒保护效果差,对D型、F型和未知型的保护率分别为20%、20%、0。本研究成功分离出1株绵羊A型多杀性巴氏杆菌,对羊巴氏杆菌病的流行监测和防控具有重要意义。     

绵羊源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

为明确从新疆某绵羊养殖场送检的病死羊的致病菌,对病死羊的心脏、肝和肺组织采用细菌分离培养、形态观察、生化试验,纯化菌落进行种特异性和荚膜血清型PCR鉴定以及药敏试验、致病性试验和动物回归试验。为了解分离菌株的生物学特性及免疫原性,笔者以BALB/c小鼠为动物模型对分离株进行同源性和异源性的免疫攻毒保护试验。结果显示,在BHI琼脂培养基上长出灰色、光滑小菌落,革兰氏染色为红色的小短杆菌;分离株能发酵葡萄糖等,符合多杀性巴氏杆菌(Pm)的生化特性;PCR扩增出大小为460bp的种特异性条带和1 045 bp的荚膜血清A型特异性条带,Blast检索结果与Pm的同源性为99.7%。结果表明,分离菌为多杀性巴氏杆菌,属于荚膜血清A型。药敏试验显示,该菌株对头孢拉定、环丙沙星、替米考星等7种药物具有敏感性;该菌株能够引起实验小鼠和兔的发病死亡,根据羔羊的发病情况和临床表现,本菌为强致病性菌株;将分离株培养物研制成不同佐剂的灭活疫苗探究其免疫效果,氢氧化铝佐剂灭活疫苗可以抵抗同源菌的攻击,保护率能够达到100%;对异源血清型Pm免疫攻毒保护效果差,对D型、F型和未知型的保护率分别为20%、20%、0。本研究成功分离出1株绵羊A型多杀性巴氏杆菌,对羊巴氏杆菌病的流行监测和防控具有重要意义。     

猪链球菌9型国内分离株毒力基因的检测及小鼠免疫试验

通过检测7株猪链球菌9型(SS9)国内分离株的毒力基因,比对7株SS9荚膜合成基因cps9j的300 bp碱基序列,以及进行7株SS9对小鼠的毒力试验和免疫保护试验,初步探讨了国内SS9的毒力特性.结果显示,7株SS9均缺失胞外因子(epf)和溶血素(sly)基因,溶茵酶释放蛋白基因(mrp)存在于GZ0665和GD0606株,orf2仅存于GZ0665株;病猪脑脊液分离株GZ0665与从健康猪扁桃体分离的6株SS9的cps9j同源性低;在7株SS9分离株和SS2分离株HA9801中,只有GZ0665和GD0606株能致死小鼠;用灭活的GZ0665菌株免疫的小鼠对同源菌株GZ0665及GD0606株攻击的保护率均为100%(10/10),用灭活的GD0606和未灭活的GD0627菌株免疫的小鼠对GD0606株攻击的保护率分别为80%(8/10)和50%(5/10),而对GZ0665株攻击的保护率分别为60%(6/10)和30%(3/10).证实,SS9病猪脑脊液分离株的毒力基因有剐于SS9健康猪扁桃体分离株和SS2.表明,小鼠可以用来区分SS9病猪脑脊液分离株与健康猪扁桃体分离株的致病力.