IGF-I和EGF对牦牛乳腺上皮细胞SND1表达的影响

本研究旨在研究不同浓度胰岛素样生长因子I(IG F-I)和表皮生长因子(EGF)对牦牛乳腺上皮细胞SDN1(金黄色葡萄球菌核酸样都铎域1)表达的影响。选取纯化的第3代牦牛乳腺上皮细胞,分别加入0、50、100、200 ng/m L IGF-I或EGF,通过实时荧光定量PCR和免疫荧光检测它们对SND1基因表达及表达蛋白分布的影响。实时荧光定量PCR和免疫荧光分析显示:IGF-I可提高牦牛乳腺上皮细胞SND1基因的表达,且具有浓度依赖性,当IGF-I浓度为200 ng/m L时,SND1基因的白表达量最高,显著高于其他浓度组(P0.05);EGF也可提高SND1基因的表达,当EGF浓度为100 ng/m L时,SND1基因和的表达量最高,显著高于其他浓度组(P0.05)。SND1蛋白主要分布于牦牛乳腺上皮细胞胞核中。研究结果表明,IGF-I、EGF可通过调控牦牛乳腺上皮细胞SND1的表达来调节泌乳机能。     

高剂量铜对断乳仔猪血液激素和生长因子水平的影响

将 60头断乳“军牧 1号”白猪分成 6组 ,分别饲以添加 0、10 0、15 0、2 0 0、2 5 0和 3 0 0mg/kg铜的基础日粮 ,进行80d的饲养试验 ,以探讨日粮铜水平对仔猪血液激素及生长因子的影响。结果表明 ,基础日粮中添加 10 0～ 3 0 0mg/kg铜能促进仔猪的生长 ,能显著促进循环血液中生长激素 (GH )、胰岛素 (INS)、游离甲状腺素 (FT4)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3 )、胰岛素样生长因子 (IGF Ⅰ )及其结合蛋白 (IGFBP3 )的分泌量 ,其中以饲料中添加 2 5 0mg/kg铜水平 ,于试验的第2 0～ 40d最明显 (P <0 .0 1)。     

猪血管内皮细胞体外生长特性的研究

试验以体外分离培养的猪血管内皮细胞为材料 ,研究了细胞的生长曲线、不同基础培养基对细胞生长的影响及胰岛素在生长液中的适宜含量。结果表明 ,传代猪血管内皮细胞接种后有1d左右的滞留期 ,然后细胞进入对数生长期 ,可持续 2d ,第 5d进入平台期 ,第 8d细胞开始脱落死亡 ;与MEM相比 ,M 199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基 ;在不用贴附基质和内皮细胞生长因子 (ECGF)的条件下 ,生长液中加入胰岛素 ,可明显促进细胞的生长和增殖 ,胰岛素的最适用量为 8μg/mL。     

山西杂交猪生理生化值的测定

我们对山西杂种猪不同日龄时血液生理生化指标、血液7种元素及毛锌、铜含量的动态变化及13种器官组织锌铜的含量进行了测定,结果报告如下。(一)材料与方法1.样品的采集及处理:(1)试验猪:选择健康的山西常见猪种杜长本、杜约本和内本猪。试验期间日粮组成及饲养条件保持同一水平。     

高剂量铜对生长猪血清铜锌铁水平和含铜酶活性及其生产性能的影响

将 60头军牧 1号生长猪 (体重为 19.2 6kg± 1.2 0kg) ,随机分成对照组和试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组 ,共 6组 ,每组 10头 ,公母各半。使用硫酸铜作为铜源 ,对照组生长猪日粮中不添加铜 ,各试验组生长猪日粮中分别添加 10 0、15 0、2 0 0、2 5 0和 3 0 0mg/kg铜 ,试验期为 80d。结果表明 ,日粮中添加不同水平的铜可显著降低血清锌水平 ,而对血清铁含量影响不大 ;试验组血清铜蓝蛋白和铜锌超氧化物歧化酶活性均有明显的增加 ;在日粮中添加不同水平的铜 (15 0～ 3 0 0mg/kg)可明显提高生长猪日增重 ,降低料重比 ,但前期 (0～ 60d)效果优于后期 (60～ 10 0d)。     

内江猪IL-15基因的表达与免疫增强作用研究

参照GenBank中猪IL-15基因的mRNA序列设计1对特异性引物,从经由刀豆蛋白A诱导培养的内江猪外周血淋巴细胞扩增猪IL-15基因;构建其成熟肽原核表达载体pMAL-pIL-15,在Rosetta(DE3)pLysS中表达;构建其真核表达载体pCI-pIL-15,与pCI-gD(PRV)联合免疫雌性BALB/c小鼠以研究其免疫增强作用.测序结果显示,内江猪IL-15基因与发表的猪IL-15基因的核苷酸同源性为97%～99%,含489 bp的完整开放阅读框.SDS-PAGE分析显示,表达的融合蛋白约为52.5 ku,约占菌体总蛋白的27%.Western-blot检测显示,所表达的融合蛋白为麦芽糖结合蛋白的融合蛋白.MTT法试验证实,该融合表达产物经初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞增殖;小鼠免疫试验显示,pCI-pIL～15能够促进小鼠脾CD4+、CD8+T细胞增殖,加强PRV-gD基因疫苗特异性中和抗体的产生.     

猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂Ts-serpin-1对人巨噬细胞THP-1的免疫调节功能研究

主要研究猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂Ts-serpin-1(WormBase:TsM_000065700)对宿主THP-1细胞的免疫调节作用。通过设计特异性引物和RT-PCR扩增技术,获得Ts-serpin-1编码序列,用qRT-PCR分析Ts-serpin-1基因在猪带绦虫成虫和中绦期幼虫的表达情况;构建pCold-Ts-serpin-1原核表达载体,诱导表达纯化重组蛋白Ts-serpin-1;用重组蛋白Ts-serpin-1处理THP-1细胞,采用qRT-PCR和ELISA方法检测Ts-serpin-1处理THP-1细胞后,各炎性细胞因子的变化情况。结果显示:获得的Ts-serpin-1目的基因长度为1 149 bp,编码382个氨基酸,含有Serpin家族特有的反应中心环。Ts-serpin-1基因在猪带绦虫成虫和中绦期幼虫均表达,且成虫表达量显著高于幼虫。重组蛋白Ts-serpin-1的分子质量约为43 ku,可抑制THP-1细胞促炎性细胞因子IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α、IFN-γ和i NOS2的表达,促进抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的分泌表达。以上结果提示,Ts-serpin-1在寄生虫-宿主互作过程中可能发挥重要作用。     

胰岛素受体mRNA在新生犊牛组织中的表达

应用半定量RT-PCR方法检测了新生犊牛中枢神经系统和外周组织中胰岛素受体(in-sulin receptor,InsR)基因的表达。结果表明,InsR基因在肝、皮下脂肪、半腱肌、胰、肾皮质、脾、心、肺、下丘脑、肠系膜淋巴结、主动脉、十二指肠、结肠、垂体、大脑皮质、小脑皮质中都有表达。其中,肝、半腱肌、下丘脑、胰、主动脉、垂体中InsR基因的表达量显著多于其他组织(P<0.05)。InsR基因在各组织中的广泛分布表明胰岛素在体内具有广泛的生理功能。     

Netrin-1在伪狂犬病病毒触发的抗病毒天然免疫反应中作用的研究

为探究轴突导向生长因子Netrin-1在病毒感染中的功能,以猪伪狂犬病病毒感染MEF细胞为模型,通过荧光定量PCR检测Netrin-1基因mRNA在感染前后表达水平的变化,结果表明,伪狂犬病病毒刺激可以使得细胞下调Netrin-1 mRNA的表达水平。以小鼠Netrin-1基因保守序列设计1对特异性引物,成功将Netrin-1克隆入pcDNA3.1载体,在MEF细胞中瞬时转染重组质粒,并用伪狂犬病病毒感染细胞,针对炎症因子IL-6、干扰素IFN-β与干扰素刺激基因IFIT1和ISG15的mRNA进行qPCR验证,结果表明,Netrin-1对于干扰素与干扰素刺激基因的表达具有抑制作用。免疫印迹试验结果证明,过表达Netrin-1使得细胞核因子P65亚基表达下调。表明Netrin-1对免疫反应具有抑制作用,细胞在受到病毒感染时下调Netrin-1的表达以促进免疫反应。     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞后病毒复制及TLR3诱导表达的影响

本试验旨在探索猴头菇多糖(HEP)对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染RAW264.7细胞中病毒复制及TLR3诱导表达的影响,为进一步解析HEP在调节MDRV所致的番鸭机体免疫抑制中的作用机制提供数据参考。本试验首先通过测定HEP在小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)上的安全浓度的基础上确定HEP的添加浓度;然后通过RT-qPCR方法和Western-blot方法分别检测各组细胞中TLR3 m RNA的转录水平和TLR3、病毒σNS的蛋白表达量,从基因和蛋白的分子层面分析HEP对MDRV感染RAW264.7细胞的免疫调节作用。结果显示:HEP在46.88～187.5μg/m L浓度范围内是可以促进RAW264.7细胞生长,浓度为93.75μg/m L时细胞相对增殖率最高,VCG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)高于BCG组,HPG与HTG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)低于VCG组。结论:HEP可从基因与蛋白水平抑制MDRV感染早期过度活化的TLR3的表达,从而起到抗病毒作用。     

高铜日粮对生长猪中脑和下丘脑中儿茶酚胺类含量的影响

选用断乳仔猪45头,随机分为3组,每组5个重复,每个重复3头,采用完全随机化设计进行生长试验,研究了不同添加水平(5、125、250mg/kg)的硫酸铜日粮对猪下丘脑及中脑儿茶酚胺类物质分泌的影响。结果,日粮中添加125mg/kg(P<0.01)、250mg/kg(P<0.05)硫酸铜均显著提高了中脑、下丘脑多巴胺含量,但是随着铜水平的提高,多巴胺含量呈下降趋势;中脑黑质去甲肾上腺素浓度在试验组与对照组之间有显著差异,并且随着铜浓度的提高有升高趋势。据此推断,高剂量铜可能通过调节中枢儿茶酚胺代谢,促进生长激素的分泌进而促进动物生长。     

恒河猴干扰素-γ基因的原核表达及其免疫活性的初步研究

为构建以恒河猴干扰素-γ为目的基因的原核表达重组质粒并进行免疫活性分析,获得具有生物学活性重组IFN-γ蛋白。应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从恒河猴外周血单个核细胞(PBM C)扩增干扰素-γ基因,然后将其克隆至表达载体p ET32a(+)中,转化BL21(D E3)进行诱导表达。SDS-PAG E电泳分析其可溶性,W estern-blot检测纯化后的重组蛋白,采用淋巴细胞增殖试验检测重组IFN-γ的活性。结果显示,成功构建恒河猴干扰素-γ原核表达重组菌,重组蛋白分子质量约为35.4 ku,主要以包涵体形式存在。重组IFN-γ具有促进淋巴细胞转化增殖的生物学活性。结果表明,本试验成功获得了重组IFN-γ蛋白,表达量高且具有生物学活性,为重组IFN-γ治疗恒河猴疾病奠定了基础。     

胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化的影响

对分离自20日龄雄性SD大鼠附睾和肾周白色脂肪组织的前体脂肪细胞进行原代培养,并采用MTT比色法、油红O染色提取法分析了100~400 nmol/L胰岛素对其增殖、分化的影响,同时利用半定量RT-PCR分析了该浓度胰岛素对分化标志基因———脂肪酸合酶(FAS)、乙酰CoA羧化酶α(ACC1)基因mRNA表达的影响。结果显示,胰岛素能有效地促进前体脂肪细胞的增殖和分化(P<0.05),在400 nmol/L以下具有剂量依赖性;胰岛素处理72 h能显著提高脂肪细胞FAS和ACC1基因mRNA的表达水平(P<0.05)。证实胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化有明显促进作用。     

猪带绦虫缺氧诱导因子-1的原核表达和真核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪带绦虫的缺氧诱导因子-1(HIF-1)并制备其特异性抗体,根据本课题组对猪带绦虫全基因组测序获得的HIF-1基因序列设计了1对特异性引物,以提取的猪带绦虫的总RNA为模板,通过RTPCR获得猪带绦虫HIF-1基因。将该基因定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析。结果显示,获得了约为17.0ku的表达产物,与目的蛋白的大小相符。原核表达的蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,ELISA和Western-blot结果表明,制备的多克隆抗体有较高的抗体效价(1∶51 200)和抗原特异性。该基因又被定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1中进行了真核表达。结果成功构建了猪带绦虫HIF-1因子的原核表达系统和真核表达系统,并制备出其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

小型猪复合麻醉剂及赛拉嗪对大鼠大脑皮层与小脑c-fos基因表达的影响

为研究小型猪复合麻醉剂(XFM)及赛拉嗪对大鼠大脑皮层与小脑c-fos基因表达的影响,将114只SD大鼠随机分为空白对照组(B组)、生理盐水对照组(C组)、XFM麻醉组(H组)和赛拉嗪组(X组)。除B组外,各组又分为6个亚组:麻醉诱导期(Ⅰ期)、翻正反射消失(Ⅱ期)、翻正反射消失后15min(Ⅲ期)、翻正反射消失后35min(Ⅳ期)、翻正反射恢复(Ⅴ期)、恢复直线爬行(Ⅵ期)。各组大鼠在对应的时间点断头处死,分离并采集大脑皮层和小脑,并分别提取RNA和蛋白质,用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测各样品中c-fos基因mRNA含量和蛋白含量。结果显示:(1)C组大鼠大脑皮层与小脑c-fos基因的表达无显著变化(P0.05);(2)H组这2个脑区c-fos基因mRNA转录量逐渐升高,在Ⅲ期达到最高(P0.01),在麻醉苏醒过程中下调;c-fos蛋白在麻醉过程中表达量上调,在麻醉苏醒后(Ⅵ期)表达量下降(P0.01);(3)X组上述脑区c-fos基因mRNA表达量上升,主要在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期明显升高(P0.01),Ⅵ期下降至接近对照组水平;c-fos蛋白表达逐渐升高,而在Ⅴ、Ⅵ期表达下降(P0.01),X组c-fos表达水平较H组表达水平低(P0.01)。结果提示:在XFM和赛拉嗪麻醉过程中,大鼠大脑皮层与小脑中c-fos基因的表达量随麻醉加深而增加,在麻醉苏醒过程中表达量下降,大脑皮层及小脑可能是XFM和赛拉嗪的麻醉作用位点,两种药物对大鼠大脑皮层与小脑内c-fos基因表达的影响可能是其麻醉作用机制之一。     

猪IFN-α1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测

利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因.序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%.用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1.探讨了猪IFN-α1.基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达.结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%.SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在.经预测,猪IFN-α1蛋白为一结构松散的球状蛋白.     

慢病毒载体介导稳定表达pAPN的Vero细胞系的构建及应用

将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒pLVX-mCherry-pAPN与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染Vero细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达pAPN的细胞。通过RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)证明了所获细胞株能够稳定表达pAPN蛋白,命名为Vero-APN-B6。IFA试验和TCID50试验结果表明:与Vero细胞相比,Vero-APN-B6更能促进猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖。利用该细胞株成功地从猪小肠组织中分离到了PEDV SC-MS株;经过鉴定该毒株为变异毒株。     

慢性铜中毒山羊临床症状、血液及肝脏变化的观察

人们对家畜急性铜中毒的认识已有数百年历史,而对慢性铜中毒的认识则主要是从本世纪20年代开始的。研究者们概括了引起家畜铜中毒的可能原因:①在含铜高的土壤上放牧;②过量食入含铜的舔盐或混合物;③不恰当地使用含铜灌剂(dre-nch);④吃食污染有农业或工业来源的铜化合物的饲料;⑤用铜作为猪的生长促进剂,误给反刍动物食用,或用此种猪粪给牧草施肥,绵羊在此草地上放牧而引起中毒。近年来,国内许多猪场也应用添加硫酸铜等制剂促进猪生长,猪粪施肥造成饲草含铜量增加,在这种牧地及某些矿山周围被铜污染的区域不宜放养绵羊,能否饲养山羊呢,回答这一问题对合理利用牧草资源大有意义,为此进行了本试验,以了解本地山羊对铜的敏感性。通过血浆铜、TCA可溶性铜、肝铜及某些血清酶测定。来监测和诊断山羊慢性铜中毒。     

禽腺联病毒序列对鸡输卵管细胞表达人溶菌酶基因的促进作用

将鸡卵清蛋白基因5′-调控区控制的人溶菌酶(hLYZ)cDNA表达盒插入禽AAV末端反向重复序列之间,将CMV启动子控制的rep表达盒插入其下游,获得的表达载体pRep2ITR-OV4-LYZ用聚乙烯亚胺包裹,经翅静脉注射产蛋鸡,待蛋清中rhLYZ表达水平下降至注射前水平时,用pRep2ITR-OV4-LYZ进行3次重复注射,以RBB-R染料标记比色法和Western-blotting检测蛋清中rhLYZ表达,以细菌生长抑制试验检测rhLYZ活性。结果,在相同试验条件下,pRep2ITR-OV4-LYZ表达rhLYZ的水平和时间优于不含禽AAV序列的pOV4-LYZ,rhLYZ表达水平和时间随载体注射次数增加呈上升和延长趋势,rhLYZ的分子质量与天然hLYZ相同,对致乳牛乳腺炎大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌具有显著的抑制作用。试验结果提示,禽AAV ITR和rep序列能促进hLYZ基因在鸡输卵管细胞中正确表达。     

猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂Tsserpin570的克隆表达与酶活性分析

为阐明猪带绦虫(Taenia solium)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Tsserpin570)对蛋白酶的抑制作用,通过RT-PCR从猪带绦虫成虫cDNA扩增获得Tsserpin570(TsM_000807300)的完整CDS序列,并构建了pColdTsserpin570原核表达载体,利用发色底物法检测可溶性重组蛋白Tsserpin570对蛋白酶活性的抑制作用。结果显示:RT-PCR扩增获得的Tsserpin570基因片段长1 206 bp,其蛋白的分子质量为46 ku,含有serpin家族特有的反应中心环及DEEGAE和FIVDHPFLFFI家族保守序列。qRT-PCR结果显示,Tsserpin570基因在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达,且在成虫的表达量显著高于囊尾蚴的。pCold-Tsserpin570原核表达载体经IPTG诱导表达后获得可溶性重组蛋白Tsserpin570,可被猪囊尾蚴阳性血清识别。基于发色底物法检测Tsserpin570对牛α-胰糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶、猪胰蛋白酶、人白细胞组织蛋白酶G、人血浆凝血酶、猪胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白酶的活性抑制作用发现,其对牛α-胰糜蛋白酶、胰蛋白酶及弹性蛋白酶的活性均有明显的抑制作用。以上结果提示,Tsserpin570对多种丝氨酸蛋白酶均具有较强的抑制作用。