HSP27在黄体期牦牛主要生殖器官中表达差异的研究

为了探讨正常生理条件下牦牛热休克蛋白27(HSP27)在黄体期牦牛主要生殖器官中的表达差异,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测了HSP27基因在黄体期牦牛卵巢、输卵管和子宫中的相对表达量,用Western-blot和免疫组织化学SP法研究了HSP27蛋白在黄体期牦牛卵巢、输卵管和子宫中的表达量和组织内分布。RT-qPCR分析表明,HSP27基因在黄体期牦牛卵巢、输卵管和子宫中均有表达,其中卵巢中的表达量分别是输卵管和子宫组织的1.03倍和4.63倍。免疫组织化学结果表明,牦牛卵泡膜内层、颗粒层、输卵管黏膜上皮、子宫内膜上皮和子宫腺中均有HSP27阳性表达。Western-blot和免疫组织化学结果表明,HSP27蛋白在黄体期牦牛各主要生殖器官组织中表达差异极显著(P0.01),其中在卵巢中表达量最高,在子宫中表达量最低。本试验结果表明,HSP27在黄体期牦牛的各个主要生殖器官中存在表达差异,这为进一步研究HSP27在哺乳动物生殖过程中发挥的作用提供了理论依据。     

GCNF在牦牛睾丸不同发育阶段中的表达与定位

生殖细胞核因子(GCNF)是核受体超家族的一员。相关研究发现,GCNF在睾丸和卵巢中高表达,可能在配子减数分裂中发挥作用。为探究GCNF在牦牛睾丸中的表达与定位,采集牦牛不同发育阶段(幼年、成年、老年)的睾丸组织,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测GCNF基因在组织中的相对表达量;采用Western-blot(WB)检测GCNF蛋白在不同年龄阶段睾丸中的表达水平;免疫组织化学方法分析GCNF在牦牛睾丸分布特征。qRT-PCR和WB检测结果显示,GCNF在牦牛睾丸不同年龄阶段均有表达,且表达存在差异性。幼年期GCNF在基因水平和蛋白水平表达量最高且显著高于成年期和老年期;老年期显著高于成年期,成年期表达量最低。免疫组织化学结果显示:在睾丸不同发育阶段GCNF的表达定位无明显差异,主要在生精细胞和圆形精子细胞中表达,间质细胞和支持细胞中也有少量表达。上述研究结果表明,GCNF可能参与精子的发生及分化变形,这为牦牛生殖生育研究提供了理论基础和新的依据。     

LHR在牦牛肾和卵巢中表达情况的研究

为了探讨牦牛肾中黄体生成素受体(LHR)的表达情况,分析肾中LHR与卵巢中LHR表达的相似性,选取青海省健康的3头2岁龄雌性牦牛,根据黄牛LHR基因序列5′端和3′端的保守性设计特异性引物,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测牦牛肾和卵巢组织中LHR基因的表达量,并运用免疫组织化学法对LHR蛋白在牦牛肾和卵巢组织中表达情况进行定位研究。RT-qPCR结果显示,牦牛肾组织中LHR mRNA的相对表达量是卵巢的79.75倍。免疫组织化学结果显示,LHR在牦牛肾组织的近曲小管和远曲小管呈阳性反应,在卵巢组织中卵泡颗粒层呈明显的阳性反应;LHR在牦牛肾和卵巢中的表达量之间差异极显著(P0.01)。结果表明,牦牛的肾组织与卵巢组织一样,均具有表达LHR的特性,提示肾可通过调节LHR参与牦牛的繁殖性能。     

FGF2和FGFR在牦牛繁殖周期子宫的表达与定位

为探索成纤维细胞因子2(fibroblast growth factor,F2GF2)及成纤维细胞因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)在健康成年牦牛繁殖周期中的生物学功能,本研究选取了不同繁殖周期(发情期-卵泡期、发情期-黄体期、妊娠期-黄体期)牦牛子宫组织,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和免疫组织化学方法从基因和蛋白水平分别检测不同繁殖周期牦牛子宫FGF2和FGFR的表达和分布,用积分光密度方法分析FGF2和FGFR蛋白表达水平。结果显示,不同繁殖周期牦牛子宫中FGF2mRNA表达水平为:发情期-卵泡期发情期-黄体期妊娠期-黄体期(P0.01);FGFRmRNA表达水平为:发情期-黄体期妊娠期-黄体期发情期-卵泡期(P0.05)。FGF2和FGFR在牦牛不同繁殖周期的子宫内膜、子宫腺及血管上皮中均有表达,子宫内膜和子宫腺为主要表达部位,阳性细胞的细胞质中表达较高。积分光密度分析结果显示,FGF2蛋白表达水平为:发情期-卵泡期子宫发情期-黄体期子宫妊娠期-黄体期子宫;FGFR蛋白表达水平为:妊娠期-黄体期子宫发情期-卵泡期子宫发情期-黄体期子宫。以上结果表明,FGF2和FGFR在不同繁殖周期的表达差异性可能与其参与早期胚胎附植及胚胎发育的调控相关,这为进一步研究FGF2和FGFR在牦牛繁殖周期中的调控作用提供了理论依据。     

不同繁殖周期成年牦牛睾丸细胞外基质相关蛋白的分布比较

应用Masson三色染色法、Gomori银浸染色法以及免疫组织化学SP法结合IPP统计分析法,比较了层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)和硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)在繁殖期和繁殖间期牦牛睾丸的分布及组织化学特征。结果,不同繁殖期牦牛睾丸间质胶原纤维及网状纤维均较为丰富;繁殖间期牦牛睾丸LN在支持细胞(sertoli cells)和生精细胞表达与繁殖期相近,在间质细胞(leydig cells)表达降低,但其平均吸光度检测无统计学差异(P0.05);ColⅣ在不同繁殖期牦牛睾丸支持细胞和各级生精细胞均有阳性表达,但繁殖期牦牛ColⅣ在近管腔面生精细胞显示有强阳性表达,平均吸光度统计表明繁殖期显著高于繁殖间期(P0.01);HSPG在不同繁殖期牦牛睾丸精原细胞及支持细胞强阳性表达,繁殖间期平均吸光度检测极显著低于繁殖期(P0.01)。上述研究结果表明,高原环境中成年牦牛睾丸间质组织纤维成分随繁殖季节变化并不明显,睾丸组织LN合成与不同繁殖季节间质细胞分泌功能变化相关,繁殖期ColⅣ合成增强更有利于精子生成,HSPG的显著增加主要与精原细胞及支持细胞分化相关。     

卵泡期和黄体期牦牛输卵管中Bcl-2和Bax的表达变化

为了研究发情周期不同阶段牦牛输卵管中Bcl-2和Bax的表达变化,采用免疫组织化学SP法和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)技术分别对黄体期和卵泡期牦牛输卵管中Bcl-2和Bax蛋白及其m RNA的表达特征进行了研究。结果显示,发情周期不同阶段Bcl-2和Bax蛋白免疫阳性产物主要表达于牦牛输卵管黏膜上皮细胞质中,且主要分布于上皮细胞游离面和基底面。黄体期Bax蛋白阳性产物表达量显著高于卵泡期,而Bcl-2表达量略低于卵泡期,但无显著差异。卵泡期和黄体期牦牛输卵管管壁中有Bcl-2和Bax m RNA表达,不同时期Bcl-2 m RNA变化无显著差异;黄体期Bax m RNA表达显著高于卵泡期。表明,Bcl-2和Bax参与了牦牛输卵管黏膜上皮细胞周期性增殖与凋亡的调控,而且这一凋亡通路中主要通过Bax的变化来实现。     

长爪沙鼠颌下腺免疫球蛋白A的定位分布

采用免疫组织化学方法对不同日龄的长爪沙鼠颌下腺IgA的定位分布进行了研究。结果表明,长爪沙鼠的颌下腺由导管部和分泌部构成,分泌部主要由浆液腺构成,导管部包括闰管、纹管、颗粒曲管和小叶间导管等。DAB显色结果表明,IgA阳性细胞主要分布于浆液性腺泡、闰管、纹管、颗粒曲管和小叶间导管,并可分布于腺泡和腺管间结缔组织,IgA阳性产物的分布具有不均一性,无明显随年龄变化的规律性。阳性产物分布于胞质中,胞核呈阴性,对照组阴性。提示从浆细胞产生或循环而来的IgA先经结缔组织进入颌下腺组织,进而定位分布于浆液腺泡和各级导管,导管部有较多的IgA分布。     

浆细胞在双峰驼消化管中的分布及形态特征

对双峰驼消化道组织标本用光镜和透射电镜观察,肠道和胃的有腺部固有膜淋巴组织中含有丰富的浆细胞,并且在肠道的分布多于胃;在肠道回肠分布最密集,其次是空肠后段和盲肠.从食管至回肠浆细胞分布逐渐增多,从盲肠至直肠逐渐减少;肠道和胃的有腺部浆细胞明显多于食管和胃的非腺体区,后者仅有极少量散在的浆细胞分布;胃的3个腺囊区腺体部和贲门腺区的浆细胞分布相似,并多于胃底腺区和幽门腺区;浆细胞在淋巴小结、集合淋巴小结以及整个消化管粘膜下层分布很少;光镜下的浆细胞为多形态,以卵圆形细胞多见;电镜下的浆细胞主要有两种表现形式,一种是胞浆内充满大小、形态不一的囊泡状粗面内质网,另一种胞浆内充满扁囊状粗面内质网,以前者多见.观察结果证实,双峰驼肠道粘膜和胃粘膜具有产生抗体的形态学基础,尤其回肠、空肠后段和盲肠是消化管粘膜产生抗体的重要免疫效应部位.     

神经元特异性烯醇化酶在大鼠动情周期子宫中的分布

选择健康、未产、体重220～250 g成年雌性SD大鼠,采用阴道涂片方法鉴定其动情周期,并采用免疫组织化学SP法研究了神经元特异性烯醇化酶(NSE)在大鼠动情周期子宫内分布的变化规律.结果显示,子宫各层均有不同程度NSE免疫阳性产物分布,并随动情周期的变化表现出一定的规律各期子宫内膜黏膜上皮细胞、腺上皮细胞、基质细胞、血管内皮细胞及肥大细胞等NSE免疫阳性细胞数量变化不大,但着色深浅有一定差别,动情期着色最深,动情后期、动情间期、动情前期着色依次减弱;肌层和子宫外膜中,动情期着色最深,动情后期着色最浅,动情间期表达量明显回升,动情前期比动情期着色稍浅.表明,NSE在子宫中的分布可能受性类固醇激素的调节.     

CD11c+DC和CD103+DC及CD68+Mφ在双峰驼肠系膜淋巴结中的分布特点

为了探讨CD11c和CD103分子标记物标记的树突状细胞(DC)及CD68分子标记物标记的巨噬细胞(Mφ)在双峰驼肠系膜淋巴结(MLN)中的形态特点和分布规律,采用SABC免疫组织化学技术对10峰成年双峰驼MLN不同部位的DC和Mφ进行了定位和观察。结果显示,CD11c阳性树突状细胞(CD11c+DC)的核较大淡染,突起细长且弯曲,环抱周围的淋巴细胞,主要分布在生发中心、滤泡间区和小梁周围;CD103阳性树突状细胞(CD103+DC)的形态在不同部位相似,细胞核大、淡染,突起不明显,形态规则,主要分布在小梁周围和滤泡间区,髓质也有较多分布,滤泡生发中心分布较少。结果表明,CD11c+DC和CD103+DC在MLN中的主要分布差异是,前者在生发中心分布较多,而后者在髓质分布较多。CD68+Mφ主要分布于胸腺依赖区的高内皮毛细血管后微静脉和髓质淋巴窦。上述三种细胞的分布特点均与它们的抗原递呈功能密切相关。     

高原牦牛肺血管内皮生长因子的分布

通过免疫组织化学染色法对1日龄牦牛肺血管内皮生长因子(VEGF)的分布进行了研究,以探讨牦牛肺对高原的适应性机理。结果显示,VEGF大量分布于导气部上皮的Clara细胞胞质和伴行肺动脉内皮细胞胞质内;在导气部上皮的纤毛细胞、管壁平滑肌内也有分布;VEGF在肺动脉平滑肌中的分布随着管径的减小而减少;在呼吸部上皮内没有VEGF分布,仅在肺泡壁有散在分布。表明,低氧能刺激1日龄牦牛肺导气部和肺动脉内的VEGF含量增加,从而对牦牛肺的发育产生影响,这可能是牦牛肺能适应高原低氧环境的重要因素。     

不同年龄牦牛淋巴结组织结构的比较

为观察牦牛淋巴结发育过程中组织结构的变化,研究牦牛淋巴结的结构发育特点,选取新生、1岁及成年健康牦牛肠系膜和下颌淋巴结样本,运用组织学方法对其组织结构进行观察与分析。结果,新生牦牛淋巴结内可见初级和次级淋巴小结,1岁及成年牦牛淋巴结中以次级淋巴小结为主。牦牛淋巴结单位面积内生发中心数量及皮质相对面积百分比随年龄增长呈先上升后下降的趋势,1岁时最高,成年次之,新生最低,各组之间差异显著(P0.05);髓质相对面积百分比随年龄增长呈先下降后上升的趋势,新生最高,成年次之,1岁时最低,各组之间差异显著(P0.05)。除新生牦牛外,1岁及成年牦牛下颌淋巴结生发中心数量均显著多于肠系膜淋巴结(P0.05);三个年龄组中下颌淋巴结皮质相对面积百分比均显著高于肠系膜淋巴结(P0.05),肠系膜淋巴结髓质相对面积百分比均显著高于下颌淋巴结(P0.05)。上述结果表明,牦牛在出生早期其淋巴结内已经形成生发中心,牦牛淋巴结组织结构的变化与年龄及其解剖位置有关。     

牦牛肺肥大细胞观察

牦牛肺肥大细胞观察近年来研究发现，肥大细胞与多种生理功能和病理过程有不同程度的关系，但有关牦牛肺肥大细胞的研究资料甚少，笔者对牦牛肺肥大细胞的分布和形态特征进行了观察。材料与方法试验用青海省玛多县（海拔４２００ｍ）临床健康的成年牦牛６头。将试验牦牛宰...     

牦牛同种移植炎症因子AIF-1基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法从成年麦洼牦牛脾中克隆到同种移植炎症因子AIF-1的编码基因,并研究了其在各组织中的表达模式.结果表明,AIF-1基因包含一个444 bp的完整阅读框,编码一由147个氨基酸组成的蛋白,推测其分子质量约为16.6 ku,与其他多种动物的AIF-1的氨基酸序列有89%～95%的同源性.RT-PCR半定量分析结果显示,AIF-1基因在麦洼牦牛的脾、肾中都有转录,在脾中表达水平相对较高,而在肝、乳腺、心、肌肉中未见明显表达.     

牦牛S100A12基因的克隆及其在生殖器官中表达情况的检测

为了解S100A12基因在牦牛生殖器官中的表达情况,采用RT-PCR技术从牦牛脾组织中扩增S100A12基因序列,用半定量RT-PCR技术和免疫组织化学染色方法分别检测S100A12基因mRNA和S100A12蛋白在牦牛脾、淋巴结、乳腺及生殖器官中的表达。结果显示,克隆的牦牛S100A12基因序列片段大小为279bp,包含一个完整开放阅读框(ORF),推导编码92个氨基酸;S100A12mRNA和蛋白在脾中表达量相对最高,在睾丸、附睾、淋巴结、乳腺、卵巢中相对强表达,在阴茎、阴道、子宫(子宫角、子宫体和子宫颈)中相对弱表达。结果表明,S100A12mRNA和蛋白在牦牛生殖器官中均有不同程度的表达,提示其在牦牛生殖过程中可能发挥一定的作用。     

不同生理状态下牦牛乳腺组织中SREBP1的表达

固醇调节元件结合蛋白1(Sterol regulatory element binding protein,SREBP1)作为一种核转录因子,与哺乳动物体内胆固醇及脂肪的生成密切相关。为了解牦牛乳腺组织中乳脂合成的机制及其特点,采集处于不同生理状态下(妊娠期、泌乳期、干奶期)的乳腺组织样品,采用qRT-PCR、Western-blot及免疫组化(immunohistochemistry,IHC)等技术检测SREBP1基因及其蛋白的相对表达情况。结果显示,泌乳期牦牛乳腺组织中SREBP1 m RNA表达量显著高于妊娠期和干奶期(P0.05),且妊娠期SREBP1 m RNA表达量高于干奶期(P0.05)。在牦牛不同生理状态下,SREBP1蛋白表达也发生了显著变化,妊娠期和泌乳期SREBP1蛋白表达量显著高于干奶期(P0.05)。免疫组化法定位检测结果显示,SREBP1蛋白主要分布在牦牛乳腺腺泡上皮细胞、乳腺导管上皮细胞及血管内皮细胞。上述结果表明SREBP1及其编码m RNA的表达在牦牛乳腺组织中与其所处不同生理状态密切相关,妊娠期和泌乳期SREBP1的高表达,可能意味着其在牦牛乳腺发育和乳脂合成的过程中发挥着重要作用。本研究为进一步探明SREBP1在牦牛乳脂合成调控中的作用积累了一些基础资料。     

成年发情期奶山羊下丘脑催产素及其mRNA的表达

应用免疫组织化学SP法和原位杂交法研究了催产素(oxytocin,OT)及OT mRNA在成年发情期奶山羊下丘脑中的分布和表达。结果,OT免疫反应阳性细胞主要分布在视上核和室旁核,在视上弥散核、弓状核、室周核和乳头体各核团也存在免疫阳性神经元;在室旁核、视上弥散核、正中隆起和第三脑室附近有较多数量的强阳性神经纤维,在交叉上核有少量阳性神经纤维。在下丘脑23个核团(区)中均能检测出OT mRNA的阳性细胞。结果表明,OT和OT mRNA在下丘脑中分布广泛,且OT可能通过轴突传递和血液运输,将OT mRNA合成的OT运送到别的核团;OT在奶山羊发情过程中发挥了重要作用。     

牦牛舌抗菌肽基因cDNA的克隆及其在生殖系统中的表达

为了解牦牛舌抗菌肽(LAP)基因序列的特征及其在生殖系统中的表达情况,采用RT-PCR法从牦牛睾丸、附睾组织中扩增LAP基因,重组到pMD19-TSimple载体中,进行了测序和序列分析,并应用RT-PCR检测了雌性牦牛生殖系统(卵巢、输卵管、子宫、阴道等组织)中LAPmRNA的表达。结果显示,克隆的LAP基因包含一195bp的完整开放阅读框(ORF),与牛LAP基因相似性达97.9%,该ORF编码的64个氨基酸含有β-防御素特征性结构,即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基;LAP在牦牛生殖系统上皮组织中均有表达。推测LAP在牦牛生殖系统的先天免疫中具有重要作用。     

双峰驼前胃腺囊区的组织学及腺细胞的超微结构

用组织学、组织化学及电镜技术对双峰驼前胃腺囊区的组织结构和腺细胞的超微结构进行了观察。结果表明:双峰驼前胃3个腺囊区的组织构造基本一致,均由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜组成。每个腺囊区都可分为有腺部和无腺部。有腺部表面衬以单层柱状上皮,固有层较厚,含较多的黏液腺,腺细胞主要为黏液细胞,另有少量的壁细胞和内分泌细胞,这些细胞的超微结构与牛、羊真胃贲门腺中的同类细胞相似。无腺部的构造与非腺囊区类似,表面被覆复层鳞状上皮,表层角化明显;固有层薄、无腺体分布;黏膜肌层薄且不连续。     

蛋白基因产物9.5在高原黄牛与平原黄牛睾丸中分布情况的比较

为了探索蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)在不同海拔地区黄牛睾丸组织中的分布特征及其与生精功能的关系,采用免疫组织化学SP法观察了PGP9.5在平原地区和高原地区黄牛睾丸组织中的分布特点。结果显示,PGP9.5显著分布于平原黄牛和高原黄牛睾丸Leydig细胞中,间质血管周围或血管壁内为阴性,生精小管内初级精母细胞为阴性,其余生精细胞为阳性;PGP9.5在平原黄牛Sertoli细胞为强阳性表达,而高原黄牛阳性信号有所减弱,仅在Sertoli细胞顶部呈弱阳性表达;PGP9.5阳性信号高原黄牛和平原黄牛表达均在睾丸头和睾丸尾较强,睾丸体最弱。结论:PGP9.5在不同海拔地区黄牛睾丸生精小管及Leydig细胞中均有分布,表明PGP9.5影响精子发生和激素合成等生殖机能活动;PGP9.5在高原黄牛Sertoli细胞中的分布明显较平原黄牛弱,提示高原环境对睾丸生精功能有一定影响。