基于高通量测序的一株鸭疫里氏杆菌的耐药表型和耐药基因分析

为研究鸭疫里氏杆菌耐药表型与耐药基因的关系,从浙江某鸭场病鸭体内分离到1株病原菌,经菌落形态和革兰染色特性观察、生化鉴定、PCR鉴定、动物回归试验,确定其为鸭疫里氏杆菌强毒株,血清凝集试验表明其为血清11型;药物敏感性分析结果显示,该菌对多黏菌素、复方新诺明、庆大霉素、四环素等耐药,对氨苄西林、头孢拉定、头孢唑林等敏感,属于多重耐药菌株;通过基因组高通量测序分析,检测到与表型相关的多黏菌素、红霉素、四环素等相关耐药基因,同时检测到多药外排泵及多药耐药蛋白基因,耐药表型与耐药基因检测结果相符。结果表明,通过高通量测序技术能准确获得鸭疫里氏杆菌分离株抗生素耐药的相关基因信息,对鸭疫里氏杆菌病的临床用药具有一定指导意义。     

115株鸭疫里氏杆菌的PFGE分型

本研究旨在通过建立鸭疫里氏杆菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)指纹图谱数据库,探讨不同来源的鸭疫里氏杆菌的流行病学及传播特征。2013年2月到2015年7月,从广东省9个城市收集具有典型鸭疫里氏杆菌病症状的病(死)鸭和鹅的脑、肝组织样品,分离培养鸭疫里氏杆菌。采用全自动微生物鉴定仪鉴定疑似菌株,并进一步用特异性PCR进行鉴定。对分离得到的菌株进行SmaⅠ-PFGE分子分型。结果显示,共分离得到115株鸭疫里氏杆菌,其中鸭源54株,鹅源61株。其中,58株菌株分型成功,得到16种不同的SmaⅠ-PFGE型(以相似度≥90%为判定标准),包括11个簇(Cluster)和5个单一型(Single type)。上述研究结果表明,分离得到的鸭疫里氏杆菌存在广泛的克隆传播,且存在于不同种属的宿主动物(鸭和鹅)之中。     

渝西地区两株鸭疫里氏杆菌的分离鉴定与药敏试验

为了解重庆西部地区养鸭场鸭疫里氏杆菌血清型的分布及耐药谱,对送检的病死鸭进行了细菌学及病毒学分离鉴定;以参考菌株RA1和RA2制备血清,用玻片凝集试验及琼脂扩散试验鉴别疑似菌株的血清型;采取纸片法进行疑似菌株的药敏试验。结果显示,分离出2株血清型为1型的鸭疫里氏杆菌,分别被命名为YM1和YM2。它们对雏鸭的致病力较强,致死率分别达60%和70%;对头孢类药物、氨基糖苷类及黏杆菌素高度敏感,对四环素类、喹诺酮类、青霉素耐药。上述结果为当地鸭疫里氏杆菌病的防制提供了科学依据。     

鸭疫里氏杆菌病的病原学特性研究

20 0 1年 6月至 2 0 0 2年 4月 ,从浙江省 7个地、市患典型鸭疫里氏杆菌病的不同品种病死鸭分离到 2 0株鸭疫里氏杆菌 (RA) ,所分离菌株对各品种雏鸭具有很强的致病性 ,各分离菌株表现出一致的形态特征和非常相似的生理生化特性。     

鸭疫里氏杆菌不同血清型广西株的分离鉴定

从广西部分地区9个发病鸭场的病料中分离出9株疑似鸭疫里氏杆菌,经培养特性、形态、染色特性及生化反应特性等鉴定为鸭疫里氏杆菌(RA).RA血清型分型试验结果表明,9株分离菌中有7株(GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX8)属血清型Ⅰ型;另2株(GX7、GX9)与GX1株的阳性血清无交叉凝集反应,GX7、GX9株制备的阳性血清也无交叉凝集反应,表明这2株菌既非Ⅰ型又不属同型的RA.经致病性试验,GX1株具很强的致病力,能使北京鸭和本地麻鸭发病死亡;GX7和GX9株仅能使北京鸭发病死亡,而不致本地麻鸭发病.结果表明,广西存在着不同血清型的RA,而且有的菌株致病性很强.     

血清5型鸭疫里氏杆菌在我国的发现及其病原特性研究

1994年 1月至 2 0 0 0年 10月 ,从全国 2 5个省、自治区、直辖市的 5～ 90日龄患典型鸭疫里氏杆菌病的种鸭和商品鸭中分离到 89株血清 5型鸭疫里氏杆菌。对其病原学特性研究结果表明 ,血清 5型鸭疫里氏杆菌病在我国鸭群感染范围极广 ;分离菌株对雏鸭具有很强的致病性 ,对小白鼠无致病性 ;各地分离菌株表现出一致的形态特征和非常相似的生理生化特性 ;各地分离菌株耐药谱很广 ,但对头孢类药物和利福平高度敏感。用分离菌株制备的灭活疫苗免疫雏鸭具有很好的免疫原性。     

鸭疫里氏杆菌转座子随机突变库的构建

通过接合转导的方法构建鸭疫里氏杆菌Yb2和CH3株的Tn4351转座子突变库,以便筛选和鉴定鸭疫里氏杆菌的功能基因。先将携带质粒pEP4351(含Tn4351转座子序列)的大肠杆菌BW19851(pEP4351)作为供体,与受体菌鸭疫里氏杆菌强毒株Yb2或CH3株进行接合转导,使质粒pEP4351导入Yb2或CH3株细菌内,进而转座子Tn4351随机插入鸭疫里氏杆菌的基因组中,然后用含红霉素和卡那霉素的胰酶大豆琼脂平板进行阳性接合子的筛选。用PCR扩增鸭疫里氏杆菌16S rRNA基因和红霉素抗性基因EmF进行转座子插入突变株的鉴定,最终成功地构建了鸭疫里氏杆菌Yb2株和CH3株各包含3 100株和2 520株突变株的Tn4351转座子随机突变库,接合转导效率分别为1.7×10-6和3.9×10-6。转座子随机突变库的构建为下一步根据突变株表型的变异来筛选和鉴定鸭疫里氏杆菌的毒力相关等基因奠定了基础。     

鸭疫里氏杆菌脂多糖单克隆抗体的制备

将鸭疫里氏杆菌CH3株作为免疫原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后将CH3株脂多糖(LPS)作为包被抗原,筛选阳性杂交瘤细胞株。共获得2株稳定分泌鸭疫里氏杆菌CH3株LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别将其命名为7H1和8A9。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价分别为1∶12 800和1∶6 400。玻片凝集试验和悬浮荧光试验检测结果表明,2株单克隆抗体与血清1型菌株WJ4发生特异性反应,而与鸭疫里氏杆菌血清2型菌株NJ-3及血清10型菌株HXb2无反应性。Westernblot结果表明,2株单克隆抗体与LPS的反应条带位于LPS O抗原部分。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的LPS单克隆抗体,可用于进一步研究鸭疫里氏杆菌LPS的结构和致病机制。     

云南省雏鸭鸭疫里氏杆菌病病原的分离鉴定

云南省红河地区的鸭群中流行一种以鼻分泌物增多、腹泻、头颈歪斜、角弓反张及脚肢无力或麻痹为特征的传染病.对现场数十只病死鸭剖检,可见纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎及脑膜充血等较为一致的病理变化;从大多数病死鸭的脑、肝、脾等组织中分离出形态一致的革兰氏阴性球杆菌,经对分离菌进行培养特性、形态特征观察和生化试验,鉴定为鸭疫里氏杆菌(Remerella anatipestifer);用分离株人工感染7日龄健康雏鸭,复制出与自然发病雏鸭相同的病例.证明该地区的雏鸭群中存在鸭疫里氏杆菌病.     

鹅源2型鸭疫里氏杆菌的分离与鉴定

从剖检表现纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎的病死雏鹅脑内分离到 1株细菌 ,定名为G0 2 0 1B株 ,经形态学观察、生化试验及血清型鉴定 ,确定为 2型鸭疫里氏杆菌。经人工感染试验 ,表明该菌对雏鹅有极强的致病力 ,致死率高达 10 0 %。     

3型鸭疫里氏杆菌的分离与鉴定

采集福州市北郊某番鸭场接种过 1型和 2型鸭疫里氏杆菌 (RA)双价灭活疫苗而发病死亡的雏鸭肝 ,从中分离到 1株RA ,经对分离菌培养特性、形态观察和血清型鉴定 ,属 3型RA。     

广东省肇庆地区鸭疫里氏杆菌病的调查

在广东省水禽养殖较密集的肇庆地区选择4个鸭疫里氏杆菌病发病鸭场和1个未发病鸭场,采集病料,进行病原分离,并用玻片凝集试验和琼脂扩散试验检测分离株的血清型.结果表明,该地区流行的鸭疫里氏杆菌(RA)仍以1型为主,但有1株与RA 1型抗血清无交叉反应.对RA分离株进行8种抗生素的敏感性试验显示,分离株对丁胺卡那霉素极度敏感,对头孢唑啉、新霉素、头孢氨苄高度敏感,对氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星有不同程度的抗药性.     

鸭疫里氏杆菌敏感烈性噬菌体的分离鉴定

为探索鸭疫里氏杆菌病的生物疗法,以富集法对健康番鸭的粪便进行了分离,获得1株鸭疫里氏杆菌敏感的烈性噬菌体,命名为RAP15.该噬菌体能裂解2株鸭疫里氏杆菌(RAf63和RAf71),说明噬菌谱较窄.透射电镜观察结果显示,该噬菌体由呈多面体的头部(直径约55 nm)和细长的尾部(长约200 nm)组成.RAP15的基因组可以被DNase Ⅰ消化,但不能被RNase A和绿豆核酸酶消化,提示其核酸类型为双股DNA.形态学和分子特征提示,RAP15属于长尾病毒科.     

鸭疫里氏杆菌病灭活疫苗的研制

从河北省某肉鸭场的鸭疫里氏杆菌病发病鸭中分离出鸭疫里氏杆菌 (Riemerellaa natipestifer ,RA)菌株。对该菌株采用液体、固体两种方法增菌培养后制成油乳剂灭活疫苗 ,以 0 .5mL/只剂量经皮下免疫 7日龄雏鸭 ,并在河北省某发病肉鸭场进行了田间试验 ,表明该疫苗免疫效果良好 ,保护率达 90 %以上     

鸭菌消治疗鸭传染性浆膜炎的研究

不同地区和同一鸭场隔3个月分离的鸭疫里氏杆菌(RA)菌株对氯霉素、氨苄青霉素、氟哌酸等的敏感性有显著差异,新兽药鸭菌消对RA高度敏感,抑菌圈直径达37 mm,对人工感染和临床病例治疗试验结果,治愈率分别达95.0%和91.2%,比氯霉素、氟哌酸、青霉素的平均治愈率高46个百分点,在各地推广应用200多万羽份,效果良好.     

鸭疫里氏杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测鸭疫里氏杆菌,以纯化的兔抗1型鸭疫里氏杆菌抗体作为捕获抗体,以纯化的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。最佳的方案为用184ng/孔纯化的多抗包被过夜,100mL/L小牛血清37℃封闭2h,检测抗原、单抗、酶标抗体均为37℃作用1h,显色20min后终止反应,D450nm值高于0.330且P/N>2.1判定为阳性。该方法特异性强,与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌无交叉反应,最低检测剂量为104 CFU/mL。与传统细菌分离方法相比,该方法的敏感性为100%,符合率为85.2%。本研究首次建立了检测鸭疫里氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法,且特异、敏感。     

鸭疫里氏杆菌外膜微孔蛋白基因的克隆和序列分析及PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鸭疫里氏杆菌(RA)外膜磷酸盐选择性微孔蛋白(Porin)基因序列设计特异性引物,以血清1、2、6、10、11、13、14和17型RA菌株的基因组DNA为模板均扩增出大小为1 212bp的目的片段,序列比对显示该基因在8种血清型菌株间同源性均大于99.6%。针对保守性最高的357bp片段设计特异性引物,建立了PCR检测方法,对鸭致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、鸭巴氏杆菌及鸭肝炎病毒均未扩增出目的条带,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验显示最小检出量为73.96pg的基因组。应用建立的PCR方法对分离自吉林、河北及北京的8个菌株进行扩增,均在357bp处扩增出清晰的目的条带,与细菌分离鉴定的符合率达100%。本研究为RA的鉴定提供了新方法,为RA外膜微孔蛋白的后续研究提供了理论依据。     

绿头野鸭鸭疫里氏杆菌的分离与鉴定

鸭疫里氏杆菌病是目前危害鸭最严重的疾病之一 ,在世界养鸭的国家和地区几乎都有本病存在 ,但还未见该菌感染绿头野鸭的报道。 1999年冬季笔者在西昌市某绿头野鸭场 ,对发病鸭进行病原分离和鉴定 ,确诊是由鸭疫里氏杆菌感染所致。1　方法1.1　现场调查　对西昌市某发病的绿头野鸭场的饲养条件、卫生管理、发病情况和临床症状进行调查 ,对典型的病鸭进行剖检 ,观察病理变化。1.2　实验室检验1.2 .1　病原分离　无菌采取临床症状典型的病鸭、死鸭的心血、脑、肝 ,分别接种于普通琼脂培养基、麦康凯培养基、鲜血琼脂培养基 ,3 7℃厌氧培养 48ｈ…     

广西南宁市鸭疫里氏杆菌病的调查与诊治

南宁市水源丰富 ,鸭养殖业兴旺。但因鸭大批量、高密度的养殖 ,鸭病的发生机率也不断增加。近几年南宁市养鸭业中鸭疫里氏杆菌病却在不断增加 ,已成为危害南宁市养鸭业的主要疫病之一。据近 2年对南宁市郊 2 63个养鸭场的调查 ,约有 90 .0 %的鸭场曾发生过鸭疫里氏杆菌病。在发病的 2 3 9个鸭场中 ,有 2 16个鸭场出现连续几批鸭发病 ,每批鸭的死亡率均在 5 .0 %以上。为了寻找有效的防治方法 ,笔者对从南宁市不同鸭场疑似本病的病鸭体内分离出的 12株病菌 ,进行了鉴别试验、药敏试验和培养特性观察。根据试验和观察结果 ,确诊这 12株病菌均…     

鸭疫里氏杆菌鸭源致病性大肠埃希氏菌和鸭沙门菌的RAPD研究

以 4株不同血清型的鸭疫里氏杆菌、5株不同血清型的鸭源致病性大肠埃希氏菌和 5株同一血清型的鸭沙门菌为研究对象 ,分别提取基因组DNA ,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行了分析。结果 ,从 2 0条随机引物中筛选出了 38条能在这 3种菌中有较好多态性的随机引物 ,8个有效引物共扩增出了 10 2个DNA片段 ,其中 14个菌株共有的谱带仅有 1条 ,显示多态性的片段有 10 1个 ,占 99.0 % ;对RA的 4个菌株扩增出的谱带数为 5 1条 ,共同片段有 12条 ,多态性片段 39条 ,占 76 .5 % ;对沙门菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 6条 ,共同片段为13条 ,多态性片段 33条 ,占 71.7% ;对大肠埃希氏菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 8条 ,共同片段 4条 ,多态性片段 4 4条 ,占 91.7%。在 8条引物中进一步筛选出 1条引物G12 ,其图谱中 5 35bp的条带为鸭疫里氏杆菌所特有 ,330bp的条带为沙门菌所特有 ,12 2 7bp的条带为大肠埃希氏菌所特有 ,表明G12可作为分子标记用来鉴别这 3种细菌。