粤西地区两株鹅源鸭疫里氏杆菌的分离鉴定

从疑似患有鸭疫里氏杆菌病的病死雏鹅分离病原菌并对分离到的菌株进行了形态学观察、生化试验、血清型鉴定、PCR鉴定、药敏试验及16SrRNA基因序列分析。结果显示,2个分离菌株为Ⅰ型鸭疫里氏杆菌;它们均对22种常用抗生素表现出耐药。这2株鹅源分离株与鸭源鸭疫里氏杆菌处于同一进化支上,与同属rRNA总科Ⅴ的伯杰氏菌属、金黄杆菌属、黄杆菌属的进化关系较近,与大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌的进化关系较远。     

鸭疫里氏杆菌不同血清型广西株的分离鉴定

从广西部分地区9个发病鸭场的病料中分离出9株疑似鸭疫里氏杆菌,经培养特性、形态、染色特性及生化反应特性等鉴定为鸭疫里氏杆菌(RA).RA血清型分型试验结果表明,9株分离菌中有7株(GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX8)属血清型Ⅰ型;另2株(GX7、GX9)与GX1株的阳性血清无交叉凝集反应,GX7、GX9株制备的阳性血清也无交叉凝集反应,表明这2株菌既非Ⅰ型又不属同型的RA.经致病性试验,GX1株具很强的致病力,能使北京鸭和本地麻鸭发病死亡;GX7和GX9株仅能使北京鸭发病死亡,而不致本地麻鸭发病.结果表明,广西存在着不同血清型的RA,而且有的菌株致病性很强.     

基于高通量测序的一株鸭疫里氏杆菌的耐药表型和耐药基因分析

为研究鸭疫里氏杆菌耐药表型与耐药基因的关系,从浙江某鸭场病鸭体内分离到1株病原菌,经菌落形态和革兰染色特性观察、生化鉴定、PCR鉴定、动物回归试验,确定其为鸭疫里氏杆菌强毒株,血清凝集试验表明其为血清11型;药物敏感性分析结果显示,该菌对多黏菌素、复方新诺明、庆大霉素、四环素等耐药,对氨苄西林、头孢拉定、头孢唑林等敏感,属于多重耐药菌株;通过基因组高通量测序分析,检测到与表型相关的多黏菌素、红霉素、四环素等相关耐药基因,同时检测到多药外排泵及多药耐药蛋白基因,耐药表型与耐药基因检测结果相符。结果表明,通过高通量测序技术能准确获得鸭疫里氏杆菌分离株抗生素耐药的相关基因信息,对鸭疫里氏杆菌病的临床用药具有一定指导意义。     

鸭疫里默氏杆菌贵州流行株的分离鉴定及耐药性分析

为了解贵州省鸭疫里默氏杆菌(Riemrella anatipestifer,RA)的流行血清型和耐药情况,本试验对贵州省三穗县4个养鸭场和安顺市某养鸭场临床疑似RA感染的病鸭进行细菌分离鉴定,并对分离菌进行致病性和耐药性分析。结果显示,从疑似病料中分离到5株病原菌,分离菌的菌落形态、菌体形态、生化特性和16S rRNA基因序列均与RA相符;5株分离菌有4株为血清2型,1株能与血清3型和血清11型RA阳性血清发生交叉凝集;动物回归试验显示,所有分离菌均可导致雏鸭发病死亡,且能复制出典型RA感染临床症状;药敏试验结果显示,所有分离菌对部分氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和氟苯尼考类抗菌药物高度耐药,对部分半合成的青霉素类和头孢类抗菌药物高度敏感;耐药基因检测结果显示,所有分离菌均携带aac(6′)-Ib、oqxA、ermF、tet(X)、floR和IntI1等6种耐药基因,与药敏试验表型相符。结果表明,贵州省三穗县目前主要流行RA血清2型,该血清型致病性强且对多种抗菌药物耐药。本试验结果为贵州省鸭疫里默氏杆菌病的防控提供了参考依据。     

鸭疫里氏杆菌病的病原学特性研究

20 0 1年 6月至 2 0 0 2年 4月 ,从浙江省 7个地、市患典型鸭疫里氏杆菌病的不同品种病死鸭分离到 2 0株鸭疫里氏杆菌 (RA) ,所分离菌株对各品种雏鸭具有很强的致病性 ,各分离菌株表现出一致的形态特征和非常相似的生理生化特性。     

广东省肇庆地区鸭疫里氏杆菌病的调查

在广东省水禽养殖较密集的肇庆地区选择4个鸭疫里氏杆菌病发病鸭场和1个未发病鸭场,采集病料,进行病原分离,并用玻片凝集试验和琼脂扩散试验检测分离株的血清型.结果表明,该地区流行的鸭疫里氏杆菌(RA)仍以1型为主,但有1株与RA 1型抗血清无交叉反应.对RA分离株进行8种抗生素的敏感性试验显示,分离株对丁胺卡那霉素极度敏感,对头孢唑啉、新霉素、头孢氨苄高度敏感,对氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星有不同程度的抗药性.     

血清5型鸭疫里氏杆菌在我国的发现及其病原特性研究

1994年 1月至 2 0 0 0年 10月 ,从全国 2 5个省、自治区、直辖市的 5～ 90日龄患典型鸭疫里氏杆菌病的种鸭和商品鸭中分离到 89株血清 5型鸭疫里氏杆菌。对其病原学特性研究结果表明 ,血清 5型鸭疫里氏杆菌病在我国鸭群感染范围极广 ;分离菌株对雏鸭具有很强的致病性 ,对小白鼠无致病性 ;各地分离菌株表现出一致的形态特征和非常相似的生理生化特性 ;各地分离菌株耐药谱很广 ,但对头孢类药物和利福平高度敏感。用分离菌株制备的灭活疫苗免疫雏鸭具有很好的免疫原性。     

3型鸭疫里氏杆菌的分离与鉴定

采集福州市北郊某番鸭场接种过 1型和 2型鸭疫里氏杆菌 (RA)双价灭活疫苗而发病死亡的雏鸭肝 ,从中分离到 1株RA ,经对分离菌培养特性、形态观察和血清型鉴定 ,属 3型RA。     

115株鸭疫里氏杆菌的PFGE分型

本研究旨在通过建立鸭疫里氏杆菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)指纹图谱数据库,探讨不同来源的鸭疫里氏杆菌的流行病学及传播特征。2013年2月到2015年7月,从广东省9个城市收集具有典型鸭疫里氏杆菌病症状的病(死)鸭和鹅的脑、肝组织样品,分离培养鸭疫里氏杆菌。采用全自动微生物鉴定仪鉴定疑似菌株,并进一步用特异性PCR进行鉴定。对分离得到的菌株进行SmaⅠ-PFGE分子分型。结果显示,共分离得到115株鸭疫里氏杆菌,其中鸭源54株,鹅源61株。其中,58株菌株分型成功,得到16种不同的SmaⅠ-PFGE型(以相似度≥90%为判定标准),包括11个簇(Cluster)和5个单一型(Single type)。上述研究结果表明,分离得到的鸭疫里氏杆菌存在广泛的克隆传播,且存在于不同种属的宿主动物(鸭和鹅)之中。     

鸭疫里氏杆菌外膜微孔蛋白基因的克隆和序列分析及PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鸭疫里氏杆菌(RA)外膜磷酸盐选择性微孔蛋白(Porin)基因序列设计特异性引物,以血清1、2、6、10、11、13、14和17型RA菌株的基因组DNA为模板均扩增出大小为1 212bp的目的片段,序列比对显示该基因在8种血清型菌株间同源性均大于99.6%。针对保守性最高的357bp片段设计特异性引物,建立了PCR检测方法,对鸭致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、鸭巴氏杆菌及鸭肝炎病毒均未扩增出目的条带,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验显示最小检出量为73.96pg的基因组。应用建立的PCR方法对分离自吉林、河北及北京的8个菌株进行扩增,均在357bp处扩增出清晰的目的条带,与细菌分离鉴定的符合率达100%。本研究为RA的鉴定提供了新方法,为RA外膜微孔蛋白的后续研究提供了理论依据。     

鸭疫里氏杆菌脂多糖单克隆抗体的制备

将鸭疫里氏杆菌CH3株作为免疫原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后将CH3株脂多糖(LPS)作为包被抗原,筛选阳性杂交瘤细胞株。共获得2株稳定分泌鸭疫里氏杆菌CH3株LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别将其命名为7H1和8A9。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价分别为1∶12 800和1∶6 400。玻片凝集试验和悬浮荧光试验检测结果表明,2株单克隆抗体与血清1型菌株WJ4发生特异性反应,而与鸭疫里氏杆菌血清2型菌株NJ-3及血清10型菌株HXb2无反应性。Westernblot结果表明,2株单克隆抗体与LPS的反应条带位于LPS O抗原部分。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的LPS单克隆抗体,可用于进一步研究鸭疫里氏杆菌LPS的结构和致病机制。     

鸭疫里氏杆菌病三价油乳剂灭活疫苗的研究

以 1、2、10型鸭疫里氏杆菌 (RA)分离株为菌种 ,研制鸭疫里氏杆菌病三价油乳剂灭活疫苗。经无菌及安全检验合格后 ,对 6日龄樱桃谷雏鸭颈部皮下接种 0 .4mL/只 ,免疫后第 10、14、2 1和 3 5d分别用 1、2、10型RA强毒株攻击 ,第 14d的攻毒保护率为 91.7%～ 10 0 % ,3 5d的攻毒保护率为 66.6%～ 83 .3 %。田间试验结果表明 ,雏鸭 5～ 7日龄免疫后至上市保护率可达 95 .0 %～ 10 0 %。     

鸭菌消治疗鸭传染性浆膜炎的研究

不同地区和同一鸭场隔3个月分离的鸭疫里氏杆菌(RA)菌株对氯霉素、氨苄青霉素、氟哌酸等的敏感性有显著差异,新兽药鸭菌消对RA高度敏感,抑菌圈直径达37 mm,对人工感染和临床病例治疗试验结果,治愈率分别达95.0%和91.2%,比氯霉素、氟哌酸、青霉素的平均治愈率高46个百分点,在各地推广应用200多万羽份,效果良好.     

六株鸭疫里默氏杆菌贵州株的分离鉴定及其耐药性分析

鉴定临床症状疑似鸭疫里默氏杆菌病的病原并分析病原耐药性。通过采集临床样本、细菌培养观察、生化试验、16S rRNA基因序列测定及动物感染试验确定6株分离株为鸭疫里默氏杆菌(RA),将其命名为RA-SS1～RA-SS6。药敏试验结果显示,分离菌株仅对头孢氨苄、氧氟沙星、利福平及磺胺异恶唑4种抗生素较为敏感,对其他常用的16种抗生素并不敏感。耐药基因检测结果显示,除arm A、bla(SHV)、bla(CTXM-9G)、erm A、erm B及erm C 6种耐药基因没有扩增出来,oqx A、oqx B、erm F、aph(3′)-Ⅱa、rmt C、aac(6′)-Ⅰb、qnr B、bla(DHA)、bla(OXA)及qnr A 10种耐药基因的检出率分别为100.0%、100.0%、100.0%、83.3%、83.3%、50.0%、50.0%、16.7%、16.7%及16.7%。结果表明:从贵州某养鸭场分离出6株RA;各分离株具耐12种以上抗生素高达100.0%,1株RA可同时耐17种抗生素,分离株对常用抗生素具有不同程度的多重耐药性;首次报道在RA分离菌株上检测出16S rRNA甲基化酶及β-内酰胺类耐药基因,RA分离菌株携带多种耐药基因。细菌耐药表型与耐药基因检出率关系紧密且在一定程度上呈正相关。本研究为RA的鉴定、治疗及其耐药机制的研究提供了科学依据。     

鸭疫里氏杆菌病四价灭活疫苗的研究

在全国流行病学调查的基础上 ,选择四川等地流行广泛的鸭疫里氏杆菌 (RA) 1、2、4和5血清型菌株制备铝胶佐剂四价灭活疫苗。对疫苗经无菌检验及安全检验合格后 ,给 3日龄樱桃谷商品鸭每只颈背皮下注射 0 .5mL ,第 10、13和 16d免疫鸭对同源RA的攻击分别表现出 5 %～2 0 %、75 %～ 90 %和 10 0 %免疫保护力 ,第 2 3～ 30d免疫保护力开始下降。用间接ELISA对免疫鸭进行抗体消长规律检测 ,表明 3日龄樱桃谷鸭首免后第 2 3d抗体达到高峰 ,至 93日龄时仍能检出抗体 ;10日龄时进行二免后可产生更高的抗体水平 ,到第 65d时仍能保持较高抗体水平。疫苗免疫雏鸭能够显著 (P <0 .0 5 )或极显著 (P <0 .0 1)地增强其T细胞的免疫力 ,时间达 2周。经攻毒保护试验、抗体消长规律测定、T细胞免疫水平测定和田间试验 ,证明研制的鸭疫里氏杆菌病(RAI)四价灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性 ,能有效预防RAI的发生     

鸭疫里氏杆菌鸭源致病性大肠埃希氏菌和鸭沙门菌的RAPD研究

以 4株不同血清型的鸭疫里氏杆菌、5株不同血清型的鸭源致病性大肠埃希氏菌和 5株同一血清型的鸭沙门菌为研究对象 ,分别提取基因组DNA ,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行了分析。结果 ,从 2 0条随机引物中筛选出了 38条能在这 3种菌中有较好多态性的随机引物 ,8个有效引物共扩增出了 10 2个DNA片段 ,其中 14个菌株共有的谱带仅有 1条 ,显示多态性的片段有 10 1个 ,占 99.0 % ;对RA的 4个菌株扩增出的谱带数为 5 1条 ,共同片段有 12条 ,多态性片段 39条 ,占 76 .5 % ;对沙门菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 6条 ,共同片段为13条 ,多态性片段 33条 ,占 71.7% ;对大肠埃希氏菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 8条 ,共同片段 4条 ,多态性片段 4 4条 ,占 91.7%。在 8条引物中进一步筛选出 1条引物G12 ,其图谱中 5 35bp的条带为鸭疫里氏杆菌所特有 ,330bp的条带为沙门菌所特有 ,12 2 7bp的条带为大肠埃希氏菌所特有 ,表明G12可作为分子标记用来鉴别这 3种细菌。     

鸭疫里氏杆菌病灭活疫苗的研制

从河北省某肉鸭场的鸭疫里氏杆菌病发病鸭中分离出鸭疫里氏杆菌 (Riemerellaa natipestifer ,RA)菌株。对该菌株采用液体、固体两种方法增菌培养后制成油乳剂灭活疫苗 ,以 0 .5mL/只剂量经皮下免疫 7日龄雏鸭 ,并在河北省某发病肉鸭场进行了田间试验 ,表明该疫苗免疫效果良好 ,保护率达 90 %以上     

鹅源2型鸭疫里氏杆菌的分离与鉴定

从剖检表现纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎的病死雏鹅脑内分离到 1株细菌 ,定名为G0 2 0 1B株 ,经形态学观察、生化试验及血清型鉴定 ,确定为 2型鸭疫里氏杆菌。经人工感染试验 ,表明该菌对雏鹅有极强的致病力 ,致死率高达 10 0 %。     

鸭疫里氏杆菌地区流行株的分离与外膜蛋白A的变异性分析

2010年从安徽省和江苏省境内发病鸭的病理组织中分离到8株鸭疫里氏杆菌(RA),分别被命名为AH1、AH2、AH3、AH4、JS1、JS2、JS3、JS4,其中AH1、JS4为血清1型,AH2、AH3、AH4、JS1、JS2、JS3为血清2型。8株RA的菌体形态、生化特性、PCR鉴定结果相同,但致病力不同,AH1毒力最弱,对鸭的发病致死率仅为16.7%。序列分析结果显示,8株分离菌的外膜蛋白A(OmpA)基因的核苷酸序列同源性为96.9%～100%,氨基酸序列同源性为98.2%～100%。将8株RA与GenBank中登录的其他55株RA的OmpA进行变异性分析,结果其核苷酸序列同源性为89.6%～100%,氨基酸序列同源性为90.2%～100%。从系统发育进化树中可将这63株RA分为4个亚群,不同国家和地区的RA株在亚群中没有显示地域或时间特征,而是呈现出了互相交叉的现象,RA的OmpA差异与血清型、分离时间和分离地点没有必然的联系,本试验近期分离的8个RA株分布在2个亚群中。     

鸭疫里氏杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测鸭疫里氏杆菌,以纯化的兔抗1型鸭疫里氏杆菌抗体作为捕获抗体,以纯化的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。最佳的方案为用184ng/孔纯化的多抗包被过夜,100mL/L小牛血清37℃封闭2h,检测抗原、单抗、酶标抗体均为37℃作用1h,显色20min后终止反应,D450nm值高于0.330且P/N>2.1判定为阳性。该方法特异性强,与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌无交叉反应,最低检测剂量为104 CFU/mL。与传统细菌分离方法相比,该方法的敏感性为100%,符合率为85.2%。本研究首次建立了检测鸭疫里氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法,且特异、敏感。