猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光LAMP检测方法的建立

本研究为建立一种检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的二重荧光(LAMP)技术,根据已发表的CSFV E2基因和PRRSV NSP2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PRRSV序列的特异性引物和2条探针,在CSFV探针5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PRRSV探针5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。用设计的引物、探针及反应试剂组成反应体系,建立CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法。对建立的方法进行特异性、敏感性、干扰性试验,并用临床样品进行验证。结果显示,本研究成功建立了鉴别CSFV和PRRSV的二重荧光LAMP方法,该方法只检测出CSFV(绿色)或PRRSV(红色)或CSFV和PRRSV混感(黄色),而对照毒株则无荧光颜色出现,具有较好的特异性。敏感性检测CSFV或PRRSV的含量浓度,其最低检测浓度均为100 copies/mL,敏感性较好。干扰性结果显示,高低不同的模板浓度不影响本方法的检测扩增,干扰性小。对112份采集的临床样品进行检测,结果,检出CSFV阳性样品41份,PRRSV阳性样品12份,CSFV和PRRSV同时为阳性的样品3份,该结果与荧光定量RT-PCR方法的检测结果一致。上述结果表明,本研究建立的CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,并具有检测临床样品中CSFV和PRRSV的潜力。     

猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝.分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性.表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测.     

猪环曲病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立快速检测猪环曲病毒(PToV)的RT-LAMP方法,根据GenBank中发表的N蛋白基因序列,设计合成4条特异性LAMP引物,通过敏感性试验和特异性试验,建立了PToV RT-LAMP检测方法,并对71份临床粪便进行了检测应用。结果显示,本试验建立的PToV RT-LAMP检测方法在65℃60min条件下可扩增出特异性梯状DNA条带,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪环曲病毒的核酸无交叉反应;检测极限为10copies/μL,比普通RT-PCR的灵敏度高10倍,表明该检测方法具有较强的特异性及灵敏性。用建立的RT-LAMP方法进行的样品检测结果显示,受检的71份样品中有17份检测结果为阳性,该结果与常规RTPCR检测结果吻合,总的阳性率为23.9%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为快速简便地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV),根据GenBank中已发布的基因序列,选择PRRSV的ORF7基因和PEDV的S基因,分别设计1对特异性引物,通过对反应体系中各成分的优化,建立了可同时检测PRRSV和PEDV的双重RT-PCR方法。本方法能从PRRSV和PEDV的混合基因组中分别扩增出300 bp和578 bp的特异性片段,且对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性;应用该方法对采自成都周边的79份临床样品进行检测,结果与单一RT-PCR的检测结果一致,具有良好的重复性;本方法检出的最小拷贝数为1.49×10~5copies/μL,敏感性也较好。本研究建立的双重RT-PCR方法具有较好实用性,可用于临床样品的检测。     

猪生殖与呼吸综合征病毒的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR检测

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白基因核酸序列设计引物,经BLAST比较发现,该引物既可以扩增较早发现的PRRSV毒株,也可以扩增近期发现的在Nsp2基因上有较大变异的PRRSV毒株,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为标准品建立了检测PRRSV的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR方法.结果表明,该方法标准曲线的相关系数大于0.99,敏感性可以达到1×101拷贝/μL,约为普通PCR的100倍;用该方法检测人工感染PRRSV的猪全血,结果阳性检出率为100%.敏感性、特异性和稳定性试验表明,该方法具有很高的敏感性、特异性和稳定性,可以用来快速检测PRRSV.     

猪瘟兔化弱毒疫苗RT-LAMP检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)野毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的NS5B基因序列,利用在线软件Pri mer Explorer V4Software,设计了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立了特异性检测HCLV的RT-LAMP方法。在BstDNA聚合酶作用下,65℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物可通过20g/L琼脂糖凝胶电泳或加入SYBR GreenⅠ染料进行分析。经检测,该方法对于CSFV、BVDV以及其他猪源病毒无特异性扩增,具有良好的HCLV特异性;其灵敏度与本实验室建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测结果一致,均达到5个拷贝。分别用这两种方法对58份市售猪瘟弱毒疫苗进行检测,结果符合率达100%。表明,建立的HCLV RT-LAMP技术可以应用于基层实验室或养殖场,便于养殖户对疫苗中的弱毒含量进行监测。     

伪狂犬病病毒野毒株新型可视化环介导等温扩增检测方法的建立

利用环介导等温扩增(LAMP)与pH指示剂结合的方式建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的快速检测方法,并优化反应体系。结果显示,该方法特异性良好、敏感性较高,检测限达100.5TCID50,与荧光定量PCR的敏感性一致。对52份临床样品进行检测,用荧光定量PCR检测出30份阳性样品,LAMP检测出27份阳性样品,二者的符合率为94.2%。结果表明,PRV野毒株新型可视化LAMP检测方法操作简便、结果判别明显、检测成本低,可预期应用于PRV带毒猪的快速筛查,这对于猪伪狂犬病的净化具有重要意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典毒株的序列差异,分别设计了1对特异性鉴别引物和1条TaqMan探针,建立了检测PRRSV变异株的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,建立的方法可鉴别诊断PRRSV变异株和经典毒株,具有较高的特异性;可以检测相当于1TCID50的病毒模板,比常规RT-PCR方法的灵敏度高100倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<10%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对13份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出11份阳性,高于常规RT-PCR方法。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法能检测高致病性PRRSV变异株,不仅特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于变异PRRSV的临床诊断和流行病学调查。     

猪瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了猪瘟病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果,根据猪瘟病毒5′端非编码区的一段保守序列设计的LAMP引物能够在65℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增,检测结果可直接用肉眼判断。结果表明,该检测体系具有极高的特异性,只能检测到目标病毒,与其他类似病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的核酸等无交叉反应,可检测到1×10-3稀释度的目标病毒核酸量,比普通RT-PCR的灵敏性高10倍。     

猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计引物和Taq Man探计,通过优化反应体系,建立了猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。结果显示,建立的方法能特异性检测猪嵴病毒,与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应,对标准品的检测灵敏度达10 copies/L;标准曲线Ct值和模板终浓度在107~10 copies/L范围内有良好的线性关系;重复性试验变异系数均小于2.5%。对139份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR阳性检出率为30.94%(43/139),常规RT-PCR为29.50%(41/139)。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪嵴病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用微芯片荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立一种可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用的核酸检测技术,本研究根据已发表的多株PRRSV ORF6(M)基因保守序列,设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种可用于PRRSV通检的微芯片荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,与多种常见的猪病病毒均无交叉反应;通检性好,可以检出包括美洲型、欧洲型、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及NADC30-like等多种基因型PRRSV毒株;灵敏性好,检测下限为1×10~1TCID_(50)/mL,与常规荧光RT-PCR方法一致;重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于4%;且成本低,模板用量少,反应快速,全程仅需61 min;对80份临床样品的检测结果与常规荧光RT-PCR的符合率为100%。本研究建立的微芯片荧光定量RT-PCR技术为PRRSV的快速、通用型检测提供了有力的技术支撑。     

伪狂犬病病毒野毒株新型可视化环介导等温扩增检测方法的建立

利用环介导等温扩增（LAMP）与pH指示剂结合的方式建立伪狂犬病病毒（PRV）野毒株的快速检测方法，并优化反应体系。结果显示，该方法特异性良好、敏感性较高，检测限达 10~(0.5) TCID_(50)，与荧光定量PCR的敏感性一致。对52 份临床样品进行检测，用荧光定量PCR检测出30份阳性样品，LAMP检测出27份阳性样品，二者的符合率为94.2%。结果表明，PRV野毒株新型可视化LAMP检测方法操作简便、结果判别明显、检测成本低，可预期应用于PRV带毒猪的快速筛查，这对于猪伪狂犬病的净化具有重要意义。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因序列设计2对反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,建立针对TGEV N基因的RT-LAMP快速检测方法,并对该检测方法的特异性与灵敏性进行了评价。该方法在63℃恒温下作用50min,使TGEV N基因获得了高效率特异性扩增,与猪流行性腹泻病毒等其他猪易感病毒无交叉反应,具有很好的特异性;同时该方法具有极高的灵敏性,可检测到131.4fg/μL的目标病毒DNA,比普通PCR的灵敏度高3个数量级。反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化,结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。经47份临床样品RT-LAMP检测结果与已得到验证的RTPCR和ELISA结果进行比对,结果显示符合率为100%。     

兔出血症病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种可视化的兔出血症病毒RT-LAMP检测方法,根据兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)的主要结构蛋白VP60基因的序列设计合成4条特异性引物,以重组pMD19-T-VP60质粒为模板,通过反应条件与反应体系优化,建立RHDV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,测定RT-LAMP对RHDV的最低检测限,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,该RT-LAMP的最佳反应温度为62℃,反应时间为40 min,对RHDV的最低检测限为50 copies/L,常规RT-PCR的检测限为5×10~3copies/L,表明建立的RT-LAMP的灵敏度显著高于常规RT-PCR。建立的RT-LAMP的全部反应可在1 h内完成;反应结束后加入荧光染料Et Br可肉眼判定粉色为阳性,而棕色则为阴性,且与兔巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌、无乳链球菌及肺炎克雷伯菌无交叉反应。上述结果表明,建立的RT-LAMP简便、快速、灵敏、特异,且不需昂贵仪器设备,适合在基层推广应用。     

水泡性口炎病毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)的快速鉴别检测方法,本研究根据水泡性口炎病毒2种血清型相对保守的L基因为靶序列,分别设计2对型特异性引物和2条不同荧光基团修饰的探针。经过对反应体系的优化,建立了能够同时检测VSV-IND和VSV-NJ的双重荧光RTPCR方法。该方法能准确鉴别VSV两种血清型,与口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无非特异性扩增,特异性强。与普通RT-PCR相比,反应快速、灵敏度高。Ct值的变异系数小于3%,重复性好。利用所建立方法对126份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR相同。上述结果表明,本研究建立的方法为VSV-IND和VSV-NJ的同时鉴别检测提供了一种快速、特异和敏感的方法。     

非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L (P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法灵敏度相当,低至10 copies,μL,检测时长仅需10 min,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应。对100份临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR结果一致,但相较于荧光定量PCR检测时间的2h,检测时间大大缩短。结果表明,本研究建立的方法灵敏度较高、特异性较好,为ASFV早期临床诊断提供了技术支持。     

猪萨佩罗病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立猪萨佩罗病毒(PSV)的检测方法,根据GenBank中PSV的5′端非编码区基因的保守序列设计并合成1对针对PSV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PSV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PSV与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪嵴病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒区分开,特异性强。检测下限为6.37×102 copies/μL,比普通PCR敏感100倍,敏感性高。扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RTPCR的批内变异系数为0.44%~1.14%,批间变异系数为0.70%~1.32%,重复性较好。应用该方法对采集自四川省部分地区的58份有腹泻症状的猪粪便进行检测,实时荧光定量RT-PCR检测阳性率为56.9%,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的实时荧光定量RT-PCR特异性较强、灵敏度高,可用于该病毒的临床检测、定量分析及流行病学调查。     

仔猪免疫PRRSV疫苗后病毒血症的荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗免疫后在猪体内病毒血症持续时间的方法。根据GenBank中PRRSV基因序列,设计1对针对N基因扩增的特异性引物,经RT-PCR扩增后连接到pMD19-T载体上,构建含有N基因片段的重组质粒。采用SYBR GreenⅠ染料法进行荧光定量RT-PCR扩增,建立标准曲线并进行特异性、敏感性及重复性试验,比较分析该方法与商品化试剂盒检测结果的阳性符合率。结果显示,所构建方法的扩增效率为1.063,标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值之间相关系数为0.999,引物特异性强,可检测的最低核酸模板浓度为1.0×10~2copies/L,比常规PCR敏感性高10倍,重复性试验的变异系数均小于1%,与商品化试剂盒检测的阳性符合率达100%。两种方法检测结果均表明,在猪体内PRRSV疫苗病毒血症可持续3周。本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,可为PRRSV感染(包括疫苗毒)的调查、监测和防控提供可行性和操作性强的技术支持。     

脑心肌炎病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测脑心肌炎病毒(EMCV)的环介导等温扩增方法(LAMP),参照GenBank中EMCV基因组序列(X74312.1),针对EMCV的3D基因保守区域设计并合成了4条引物,对建立的反应体系进行条件优化,并进行特异性、敏感性试验及临床样本的检测。结果显示,成功建立了EMCV LAMP检测方法,且当内、外引物浓度比例为5∶1(即内、外引物浓度分别为50μmol/L、10μmol/L),反应温度为64℃,反应时间为60min时反应体系可达最佳。特异性和敏感性试验表明,该方法能够特异性地检测EMCV,且敏感性比常规RT-PCR法高10倍。分别用建立的LAMP法与ELISA法对临床样本进行检测,结果二者的符合率为97%。表明建立的LAMP方法特异性强、敏感性高,可适用于EMCV临床样本的快速检测。