猪NF-κB真核表达载体的构建及转染Marc-145细胞对PRRSV增殖的影响

为研究猪细胞核转录因子-kappa B(NF-κB,p50/p65)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外增殖的影响,从猪外周血淋巴细胞扩增NF-κB p65ORF和p50RHD功能区,分别克隆至pcDNA3.1(+),经酶切及测序鉴定,获得pcDNA3.1(+)-p50-RHD及pcDNA3.1(+)-p65。将其转染至Marc-145细胞,Western-blot检测胞核内p50、p65的表达水平。pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-p50-RHD、pcDNA3.1(+)-p65和pcDNA3.1(+)-p50-RHD+pcDNA3.1(+)-p65分别转染Marc-145,18h后接种PRRSV,采用实时荧光定量PCR检测培养上清病毒粒子增殖时相,绘制一步生长曲线。结果表明,成功构建了猪NF-κB p50、NF-κB p65真核表达载体,且可在Marc-145细胞中表达。转染p50+p65、p65真核表达质粒可加速PRRSV感染Marc-145细胞后CPE进程,抑制PRRSV增殖,极大降低病毒效价,且p50+p65抑制作用更强;转染p50质粒则推迟CPE出现,减缓PRRSV增殖,但对病毒效价影响不大。本研究结果表明,NF-κB p50/p65、p65/p65对PRRSV在Marc-145细胞中的增殖有一定的抑制作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪肺泡巨噬细胞产生Ⅰ型干扰素mRNA转录水平的影响

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)对其产生Ⅰ型干扰素mRNA转录水平的影响,从猪繁殖与呼吸综合征阴性的健康仔猪肺中分离和培养PAMs,随机将其分为正常对照组、PRRSV感染组和poly(I:C)处理组。于感染后第12、24、36、48、60小时分别收集细胞,运用半定量RT-PCR法检测PAMs产生Ⅰ型干扰素的mRNA转录情况。结果显示,与正常对照组和poly(I:C)处理组相比,PRRSV感染组中IFN-α/βmRNA转录水平在各时间段均显著下调。其中,PRRSV感染组中IFN-αmRNA的转录在感染后第12~36小时呈先升高后降低的趋势,在第48小时有所上调,但在感染后第60小时IFN-αmRNA的转录显著下调;而IFN-βmRNA的转录在感染后第12~24小时基本没有变化,在第36小时最低,在感染后第48小时有所上调,但在感染后第60小时IFN-βmRNA的转录显著下调。结果表明,PRRSV可导致PAMs产生Ⅰ型干扰素的mRNA转录水平降低,从而使宿主细胞及机体非特异性免疫功能受到抑制。     

LncRNA TCONS_00179042对Marc-145细胞中PRRSV复制的影响

应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_00179042全长序列;通过q PCR、TCID50测定和Westernblot分析该Lnc RNA对PRRSV GSWW15株复制的影响;通过核质分离试验对PAMs细胞中Lnc RNA TCONS_00179042进行定位和半定量分析。RT-PCR检测结果显示,Lnc RNA TCONS_00179042长度约为430 bp。pc DNA3.1-TCONS_00179042过表达载体转染Marc-145细胞后,q PCR结果显示:该Lnc RNA的相对表达量约是对照组的3×105倍,表明Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中过表达。利用PRRSV GSWW15株感染过表达Lnc RNA TCONS_00179042的Marc-145细胞后,q PCR结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV RNA拷贝数约为对照组的60%;TCID50检测结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV病毒滴度显著低于对照组,约为对照组的20%;Western-blot试验结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV N蛋白的表达量显著低于对照组。三组数据均显示,Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中抑制PRRSV GSWW15株的复制。核质分离试验结果显示,不论是细胞质还是细胞核均有Lnc RNA TCONS_00179042存在,且细胞核中的表达量大于细胞质中。本研究结果表明,该Lnc RNA能在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制,能作为一种抗病毒分子参与调控宿主的抗病毒反应。     

口疮病毒B4R锚蛋白抑制细胞NF-κB信号通路的研究

为明确口疮病毒(ORFV)编码的B4R蛋白调节细胞N F-κB活化的作用,以ORFV ORF008基因编码的B4R蛋白为研究对象,构建真核表达载体p CM V-Flag008,转染293T细胞,首先,利用双荧光素酶报告基因系统分析B4R蛋白对NF-κB信号活化的调节作用;其次,采用W estern-blot检测B4R蛋白对NF-κB信号通路中NF-κB p65蛋白核移位和IκBα蛋白磷酸化水平的影响。结果显示,B4R蛋白对NF-κB转录因子报告载体荧光素酶活性有明显的抑制作用(P0.05);B4R蛋白能阻止IκBα蛋白磷酸化降解过程而抑制细胞NF-κB p65蛋白核移位。由此可见,ORFV编码的B4R蛋白能抑制细胞NF-κB信号通路的活化。     

食淀粉乳杆菌对猪轮状病毒感染中NSP1及IκB/NF-κB通路mRNA表达的影响

为探究食淀粉乳杆菌对轮状病毒感染中NSP1及NF-κB通路mRNA表达的影响,将食淀粉乳杆菌及其分泌上清分别作用于轮状病毒感染的乳鼠和IPEC-J2细胞,采用荧光定量PCR技术测定各组NSP1和IκB/NF-κB通路的mRNA水平变化。体内与体外试验结果显示,食淀粉乳杆菌及其分泌上清可显著下调NSP1 mRNA的表达(P0.05)。体外试验中,预防性干预组(BI组)IκB、NF-κB整体趋势相似,与正常对照组相比NF-κB mRNA上调显著(P0.05),与轮状病毒组(RV组)和治疗性干预组(AI组)相比表达相对平稳,IκB mRNA在第4到6小时上调显著(P0.05);体内试验中,在乳鼠感染轮状病毒的3 d内BI组NF-κB mRNA显著上调且与RV组和AI组差异显著(P0.05);第3天时BI组IκB mRNA水平上调高于RV组和AI组且差异显著(P0.05),RV组和AI组无显著性差异(P0.05)。结果表明,食淀粉乳杆菌及其分泌上清能够有效下调猪轮状病毒NSP1的mRNA表达,在激活IκB/NF-κB通路、提高机体先天性免疫方面具有积极作用,而且预防作用优于治疗作用。     

感染旋毛虫后小鼠腹腔巨噬细胞NOD1样受体及相关细胞因子的表达动态分析

为了解感染旋毛虫后宿主巨噬细胞NOD1受体及其信号通路中关键分子与相关细胞因子的表达动态,将一定量旋毛虫肌幼虫经口感染小鼠,在感染后第0.5、4、7、14、21、28、35天分别取小鼠腹腔巨噬细胞,应用荧光定量PCR检测细胞中NOD1、RIP2、NF-κB mRNA表达量,Western-blot测定NOD1、RIP2、NF-κB蛋白表达量,ELISA测定细胞培养上清及血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的质量浓度。荧光定量PCR结果显示,感染旋毛虫后巨噬细胞中NOD1、RIP2、NF-κB的mRNA表达量变化趋势基本一致,均呈现"升高-降低-升高-降低-平稳"的态势,且分别在感染后第4和21天各具有1个mRNA表达量峰值,在第28～35天时mRNA水平降低并趋向稳定。Western-blot结果表明,NOD1、RIP2和NF-κB p-p65的蛋白质量浓度变化趋势与其mRNA表达量检测结果基本一致。ELISA结果显示,感染小鼠腹腔巨噬细胞培养上清和小鼠血清中TNF-α、IL-6的质量浓度与对照组相比变化明显(P0.01,P0.05),变化趋势与NOD1、RIP2和NF-κB的变化相似,IL-1β的质量浓度变化程度不明显。结果表明,旋毛虫感染可以引起小鼠NOD1受体的激活,在旋毛虫生活史的特定时期上调NOD1受体通路中关键分子RIP2和下游分子NF-κB的表达,促进细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。试验证明,宿主NOD1受体参与了旋毛虫感染引起的免疫应答,为防治旋毛虫病和理解旋毛虫对宿主的感染机制提供了新的思路。     

脂多糖诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB的表达

通过研究脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB亚单位P65蛋白mRNA的表达变化,从细胞水平深入探讨子宫内膜炎的发病机理。将奶牛子宫内膜上皮细胞传代培养,采用1、10、50、100、1000μg/mL五个浓度梯度的LPS刺激子宫内膜上皮细胞,MTT法筛选最佳刺激浓度;以上述最佳刺激浓度刺激细胞,于0、0.5、1、2、4h后收集细胞,荧光定量RT-PCR检测p65 mRNA的表达差异性。结果显示,100μg/mLLPS为最佳刺激浓度;LPS刺激1h组p65 mRNA的表达极显著(P0.01)高于其他时间组;2h组显著(P0.05)高于0、0.5和4h组;0.5和4h组显著(P0.05)高于0h组。结果表明,LPS可诱导奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB的激活,LPS介导的NF-κB信号通路存在于奶牛子宫内膜上皮细胞中,并参与子宫内膜炎发病机理的调控。     

大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1和NF-κB及TLR4表达的影响

为研究大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1表达的影响以及对其信号转导通路Toll样受体4(TLR4)的表达和核转录因子κB(NF-κB)活化的影响,采用热灭活的不同浓度大肠杆菌菌液(0、1×105、1×106、1×108 CFU/mL)作用于奶牛乳腺成纤维细胞,分别于不同时间点(作用后第6、12、24、48小时)运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGF-β1和TLR4mRNA的表达,运用Western-blot检测TGF-β1、TLR4和p-NF-κB-p65蛋白的相对表达量。结果显示,大肠杆菌作用BMFB后,TGF-β1mRNA和蛋白的表达量显著的升高,并且TGF-β1mRNA的表达呈明显的时效及量效关系,于第24小时达到高峰后降低(P0.05);TGF-β1蛋白的表达量呈量效性(P0.05)。TLR4mRNA和蛋白表达水平显著升高,并且TLR4mRNA和蛋白的表达呈时效性和量效性,分别于作用后第24和12小时达到最高后逐渐下降(P0.05)。p-NF-κB-p65的表达与大肠杆菌作用浓度呈正量效关系,表达量随作用时间延长先升高后逐渐降低(P0.05)。上述研究结果表明,热灭活的大肠杆菌能够促进BMFB的TLR4表达,并激活BMFB p-NF-κB-p65蛋白的表达,从而促进TGF-β1的表达。     

致病性大肠杆菌HPI对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响

为探讨致病性大肠杆菌HPI对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响,本研究从猪外周血分离中性粒细胞,分别用HPI阳性株和HPI阴性株的大肠杆菌感染细胞,于大肠杆菌感染后的第2、6、12、24小时收集细胞,应用荧光定量PCR检测细胞内TLR4、NF-κB、My D88、IκB-αm RNA表达水平,ELISA检测NF-κB、IκB-α及炎性因子TNF-α和IL-1的含量变化。结果显示,与对照组相比,大肠杆菌感染后,TLR4/NF-κB信号通路中各基因的表达及炎性因子TNF-α和IL-1的含量普遍呈上调趋势,均高于对照组,且HPI阳性组基本高于HPI阴性组。由此可知,大肠杆菌HPI对TLR4/NF-κB信号通路具有激活作用,其通过上调TLR4、NF-κB、My D88、IκB-α的表达而促进炎性因子TNF-α和IL-1的释放,诱发炎症反应。     

CVN重组蛋白体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

本研究以Gen Bank中蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)基因序列(DQ668406.1)为基础,合成CVN基因,构建表达质粒pMAL-c5x-CVN,通过优化诱导条件,表达出可溶性CVN重组蛋白。利用cck8试剂盒检测CVN重组蛋白对Marc-145细胞的毒性,并在安全浓度范围内进行了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)试验。在PRRSV感染Marc-145细胞的吸附、穿入和复制三个阶段进行检测,探究CVN体外抗PRRSV的作用效果。各阶段的病毒TCID_(50)检测、间接免疫荧光试验以及qPCR测定结果表明,CVN在PRRSV感染宿主细胞过程中的入侵阶段发挥阻断作用,而在病毒吸附细胞和在细胞内复制的阶段没有抑制效果。本研究为新型抗PRRSV药物的研发奠定了试验基础。     

穿心莲内酯对LPS诱导的小鼠乳腺炎的抗炎作用

穿心莲内酯是从穿心莲中提取的主要药效成分,具有明显的抗炎作用。本试验旨在研究穿心莲内酯抗LPS诱发的小鼠乳腺炎的信号转导机制。选取36只分娩后第5~7天的初产、泌乳母鼠,随机将其分为6组,用LPS灌注乳池,建立小鼠乳腺炎模型。分别以不同质量浓度的穿心莲内酯(2.5、5、10 mg/kg)及地塞米松(5 mg/kg)经腹腔注射给药后第24小时,采取乳腺组织。通过组织切片观察乳腺组织的病理变化;分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR(qRT-PCR)测定促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的质量浓度及其mRNA表达水平;采用蛋白免疫印迹(Western-blot)测定NF-κB、p38、ERK和JNK的蛋白表达水平。结果显示,与LPS组相比,穿心莲内酯能减轻乳腺组织的病理损伤,抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-1β的表达,并呈现剂量依赖性;同时,穿心莲内酯抑制了转录因子p65的入核表达水平和Iκ-B、JNK、ERK1/2、p38的磷酸化水平。上述试验结果表明,穿心莲内酯通过抑制NF-κB和MAPKs信号转导通路,进而抑制促炎细胞因子的产生及其mRNA表达,最终发挥抗炎作用。     

猪IFN-β免疫压力下猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GD07株在Marc-145细胞中在添加或不添加猪干扰素-β(swIFN-β)免疫压力条件下连续传代,将获得的新毒株进行病毒生物学分析、序列测定和IFN-βmRNA水平检测。结果显示,传代后病毒效价逐渐降低,swIFN-β对自然传代和免疫压力下传代毒株的抑制作用下降,且对swIFN-β免疫压力下传代毒株的抑制作用下降的程度较大。序列分析表明,ORF3和ORF5序列的变异导致氨基酸发生变异。荧光定量RT-PCR检测表明,swIFN-β免疫压力下传代病毒感染Marc-145细胞的IFN-βmRNA水平低于自然传代毒株的相应指标,两者均远低于poly(I∶C)刺激细胞后的IFN-βmRNA水平。结果表明,swIFN-β免疫压对PRRSV的遗传变异有正向加速作用。     

不同浓度脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞对NF-κB及LAP表达的影响

为了观察不同浓度脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞NF-κB及LAP基因表达的影响,设置不同浓度(0、50、100、200、400和800ng/mL)的脂多糖(LPS)刺激奶牛乳腺上皮细胞,分别于刺激2、4、8、16、24、48和72h后提取细胞总RNA,经反转录反应后,运用荧光定量PCR方法检测NF-κB P65亚单位和LAP的表达水平。结果,与空白对照组相比,脂多糖浓度达到400ng/mL并培养72h后,奶牛乳腺上皮细胞NF-κB P65亚单位和LAP的表达量最高,且与对照组有极显著差异(P<0.01)。结果表明,在脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性效应中,NF-κB的表达活性增强,调控着防御基因LAP表达,呈现一定的剂量和时间效应关系。     

重组CFP10-ESAT6蛋白通过TLR信号介导A549细胞抗BCG感染

本研究旨在探究重组CFP10-ESAT6蛋白在结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染肺泡上皮细胞过程中对肺泡上皮细胞TLR信号途径及其介导的炎症反应的影响。利用原核表达系统表达纯化Mtb重组蛋白CFP10-ESAT6,使用重组蛋白处理A549细胞,利用CCK-8试剂盒检测重组CFP10-ESAT6对细胞活性的影响;使用重组CFP10-ESAT6和减毒牛分支杆菌BCG处理细胞并设置相应组别,提取细胞总RNA和总蛋白,利用qRT-PCR技术、Western-blot及ELISA方法分别从转录和翻译水平检测A549细胞中TLR信号途径关键分子及其下游炎症因子的表达变化。结果显示,成功获得高纯度的重组CFP10-ESAT6,并且重组CFP10-ESAT6在一定浓度范围和处理时间条件下能够降低A549细胞的存活率。当BCG或重组CFP10-ESAT6单独处理A549细胞时,细胞中TLR2、TLR4、My D88、TRAF6和NF-κB p65及下游炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平显著(P0.05)或极显著(P0.01)上调,重组CFP10-ESAT6与BCG共处理时,重组CFP10-ESAT6显著(P0.05)降低了由BCG刺激所导致的TLR途径关键分子TLR2、TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB p65、IL-6及TNF-α等炎症因子的表达水平。上述结果表明,重组CFP10-ESAT6可以减轻A549细胞在抗Mtb感染过程中由TLR信号介导的炎症因子的分泌,这将为进一步加深理解结核病发病机制提供理论依据。     

禽呼肠孤病毒σA基因对鸡胚成纤维细胞天然免疫相关基因转录水平的调控影响

为了明确禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σA基因对宿主天然免疫应答的影响,本研究利用实时荧光定量PCR方法检测pCAGEN-σA转染鸡胚成纤维细胞(DF1)后,不同时间点(转染后第3、6、12、24和36小时)DF1细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、MAVS、My D88、TRIF、IRF-3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL等基因的转录水平变化。结果,与空载体转染细胞相比,pCAGEN-σA转染细胞中上述这些天然免疫基因的m RNA水平出现不同程度变化(P0.05或P0.01)。TLR3应对最快速,其m RNA水平在转染后第3小时和第6小时迅速上升,但9 h后逐渐下降;MDA5和TLR7的m RNA水平,则分别在转染后第6小时和第12小时开始显著升高,并分别在转染后第12小时和第36小时达到峰值(P0.05或P0.01);TLR15的m RNA水平整体变化不明显。My D88和MAVS的m RNA水平呈表达上调趋势;TRIF在转染后第6小时表达量迅速达到峰值(2.83倍),随后急速下降。NF-κB呈表达上调趋势;而IRF3/7的表达则被抑制。I型干扰素(IFN-α和IFN-β)呈现相似的表达模式,在转染后第6小时和第24小时表达量增加,其他时间点均为表达量下降; IL-6和IL-8则表达上调,分别在转染后第9小时和第6小时达到峰值(P0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的m RNA水平也显著升高,均在转染后第12小时达到峰值(P0.01)。上述试验结果表明,在DF-1细胞中过表达σA基因,能显著引起天然免疫相关基因的表达的变化,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机理奠定了基础。     

通过基因组合成构建美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆

根据已测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GSWW分离株的全长基因组序列信息,采用合成生物学的方法,将全长基因组序列分为两段(7 636 bp和7 774 bp)分别连接到低拷贝载体p BR-322载体中,然后将2个半长片段相连接得到全长c DNA克隆。将质粒线性化后,体外转录获得全长RNA,经电穿孔转染BHK21细胞拯救获得了初代病毒。将初代病毒接种感染Marc-145细胞进行传代,接毒后第36小时即可观察到完全的致细胞病变效应(CPE)。通过RT-PCR、间接免疫荧光、测序验证,证明成功获得了PRRSV GSWW株的感染性克隆。通过实时荧光定量法检测拯救病毒与原田间分离毒的复制能力,没有显著差异,采用实时荧光定量法测得的拯救病毒复制的最高效价为1×1010copies/m L。本研究表明,采用长片段基因合成的方法进行PRRSV感染性克隆的构建,方法可行且速度快,为PRRSV流行毒感染致病机理、免疫机制和基于反向遗传学的新型疫苗研制提供了重要的分子工具。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增GP5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码GP5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒GP5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达GP5蛋白。同时,中和试验结果初步表明GP5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示GP5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。     

禽呼肠孤病毒感染鸡胚成纤维细胞后三种细胞因子基因mRNA转录水平的动态变化

为了分析禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)对细胞产生的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影响,并探讨禽呼肠孤病毒的感染机制及病毒与宿主之间的作用关系,运用实时荧光定量RT-PCR技术,测定和分析了ARV-S1133感染CEF细胞后ARV结构蛋白σC和IL-1β、IL-6、TNF-α的动态转录水平。结果显示,ARV-S1133感染CEF后第10小时起病毒σC基因mRNA的相对表达量开始迅速上升,在第48小时达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量发生变化,这3个基因mRNA的表达变化趋势相似。IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA转录水平在感染早期迅速上升,在感染后第6小时达到第1个峰值,随后下降,在感染中后期再次显著上升,在第48小时达到第2个峰值。IL-1β、IL-6、TNF-α在感染后第6、24、36和48小时的mRNA转录水平与对照组差异极显著(P0.01)。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-1β、IL-6、TNF-α的水平上调,进而发生炎症反应,说明IL-1β、IL-6、TNF-α可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。     

金丝桃素体外抗高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒活性的研究

为研究金丝桃素体外对高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性的影响,以Marc-145细胞培养增殖的PRRSV为研究对象,通过噻唑蓝(MTT)比色法和观察细胞病变效应(CPE),测定吸光度值(D490nm)和半数细胞感染量(TCID50),以细胞存活率、病毒抑制率和TCID50为指标,评价不同剂量的金丝桃素体外抑制PRRSV活性的效应,并通过改变加药方式(同时、感染前、感染后给药).探讨其抗PRRSV的作用机制.结果表明,在PRRSV感染的同时加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率略有升高,与PRRSV对照组和拉米夫定对照组相比,均有显著性差异(P<0.01).在PRRSV感染前和感染后加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率明显升高,且随药物浓度的增加而上升,与PRRSV对照组相比,有显著性差异(P<0.01),与拉米夫定对照组相比无统计学意义(P>0.05).金丝桃素可使PRRSV的TCID50从6.1下降至4.15.证实,金丝桃素具有多环节体外抗PRRSV效应;不同浓度的金丝桃素表现出不同的抗PRRSV活性,并呈现剂量依赖关系.