鸭疫里氏杆菌敏感烈性噬菌体RAP44的生物学特性

为了解鸭疫里氏杆菌烈性噬菌体RAP44的临床应用潜力,按常规方法对其生物学特性进行了测定。结果显示,该噬菌体在pH5～pH9的环境中稳定;55℃以下作用30min仍可保持较高裂解活性;加入15mmol/L的Mg2+或20mmol/L的Ca2+后噬菌体RAP44的出斑率分别提高61.9%和53.8%;最佳感染复数为1/40;潜伏期为10min,裂解期为40min,裂解量为83;SDS-PAGE分析结果显示,有2种主要的衣壳蛋白,分子质量分别为40ku和17ku;其基因组约为40kb。表明,噬菌体RAP44潜伏期短,裂解量大,可作为生物防治鸭疫里氏杆菌的候选噬菌体株。     

115株鸭疫里氏杆菌的PFGE分型

本研究旨在通过建立鸭疫里氏杆菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)指纹图谱数据库,探讨不同来源的鸭疫里氏杆菌的流行病学及传播特征。2013年2月到2015年7月,从广东省9个城市收集具有典型鸭疫里氏杆菌病症状的病(死)鸭和鹅的脑、肝组织样品,分离培养鸭疫里氏杆菌。采用全自动微生物鉴定仪鉴定疑似菌株,并进一步用特异性PCR进行鉴定。对分离得到的菌株进行SmaⅠ-PFGE分子分型。结果显示,共分离得到115株鸭疫里氏杆菌,其中鸭源54株,鹅源61株。其中,58株菌株分型成功,得到16种不同的SmaⅠ-PFGE型(以相似度≥90%为判定标准),包括11个簇(Cluster)和5个单一型(Single type)。上述研究结果表明,分离得到的鸭疫里氏杆菌存在广泛的克隆传播,且存在于不同种属的宿主动物(鸭和鹅)之中。     

鸭疫里氏杆菌转座子随机突变库的构建

通过接合转导的方法构建鸭疫里氏杆菌Yb2和CH3株的Tn4351转座子突变库,以便筛选和鉴定鸭疫里氏杆菌的功能基因。先将携带质粒pEP4351(含Tn4351转座子序列)的大肠杆菌BW19851(pEP4351)作为供体,与受体菌鸭疫里氏杆菌强毒株Yb2或CH3株进行接合转导,使质粒pEP4351导入Yb2或CH3株细菌内,进而转座子Tn4351随机插入鸭疫里氏杆菌的基因组中,然后用含红霉素和卡那霉素的胰酶大豆琼脂平板进行阳性接合子的筛选。用PCR扩增鸭疫里氏杆菌16S rRNA基因和红霉素抗性基因EmF进行转座子插入突变株的鉴定,最终成功地构建了鸭疫里氏杆菌Yb2株和CH3株各包含3 100株和2 520株突变株的Tn4351转座子随机突变库,接合转导效率分别为1.7×10-6和3.9×10-6。转座子随机突变库的构建为下一步根据突变株表型的变异来筛选和鉴定鸭疫里氏杆菌的毒力相关等基因奠定了基础。     

广东省肇庆地区鸭疫里氏杆菌病的调查

在广东省水禽养殖较密集的肇庆地区选择4个鸭疫里氏杆菌病发病鸭场和1个未发病鸭场,采集病料,进行病原分离,并用玻片凝集试验和琼脂扩散试验检测分离株的血清型.结果表明,该地区流行的鸭疫里氏杆菌(RA)仍以1型为主,但有1株与RA 1型抗血清无交叉反应.对RA分离株进行8种抗生素的敏感性试验显示,分离株对丁胺卡那霉素极度敏感,对头孢唑啉、新霉素、头孢氨苄高度敏感,对氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星有不同程度的抗药性.     

鸭疫里氏杆菌脂多糖单克隆抗体的制备

将鸭疫里氏杆菌CH3株作为免疫原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后将CH3株脂多糖(LPS)作为包被抗原,筛选阳性杂交瘤细胞株。共获得2株稳定分泌鸭疫里氏杆菌CH3株LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别将其命名为7H1和8A9。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价分别为1∶12 800和1∶6 400。玻片凝集试验和悬浮荧光试验检测结果表明,2株单克隆抗体与血清1型菌株WJ4发生特异性反应,而与鸭疫里氏杆菌血清2型菌株NJ-3及血清10型菌株HXb2无反应性。Westernblot结果表明,2株单克隆抗体与LPS的反应条带位于LPS O抗原部分。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的LPS单克隆抗体,可用于进一步研究鸭疫里氏杆菌LPS的结构和致病机制。     

鸭疫里氏杆菌病的病原学特性研究

20 0 1年 6月至 2 0 0 2年 4月 ,从浙江省 7个地、市患典型鸭疫里氏杆菌病的不同品种病死鸭分离到 2 0株鸭疫里氏杆菌 (RA) ,所分离菌株对各品种雏鸭具有很强的致病性 ,各分离菌株表现出一致的形态特征和非常相似的生理生化特性。     

鸭疫里氏杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测鸭疫里氏杆菌,以纯化的兔抗1型鸭疫里氏杆菌抗体作为捕获抗体,以纯化的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。最佳的方案为用184ng/孔纯化的多抗包被过夜,100mL/L小牛血清37℃封闭2h,检测抗原、单抗、酶标抗体均为37℃作用1h,显色20min后终止反应,D450nm值高于0.330且P/N>2.1判定为阳性。该方法特异性强,与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌无交叉反应,最低检测剂量为104 CFU/mL。与传统细菌分离方法相比,该方法的敏感性为100%,符合率为85.2%。本研究首次建立了检测鸭疫里氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法,且特异、敏感。     

云南省雏鸭鸭疫里氏杆菌病病原的分离鉴定

云南省红河地区的鸭群中流行一种以鼻分泌物增多、腹泻、头颈歪斜、角弓反张及脚肢无力或麻痹为特征的传染病.对现场数十只病死鸭剖检,可见纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎及脑膜充血等较为一致的病理变化;从大多数病死鸭的脑、肝、脾等组织中分离出形态一致的革兰氏阴性球杆菌,经对分离菌进行培养特性、形态特征观察和生化试验,鉴定为鸭疫里氏杆菌(Remerella anatipestifer);用分离株人工感染7日龄健康雏鸭,复制出与自然发病雏鸭相同的病例.证明该地区的雏鸭群中存在鸭疫里氏杆菌病.     

基于高通量测序的一株鸭疫里氏杆菌的耐药表型和耐药基因分析

为研究鸭疫里氏杆菌耐药表型与耐药基因的关系,从浙江某鸭场病鸭体内分离到1株病原菌,经菌落形态和革兰染色特性观察、生化鉴定、PCR鉴定、动物回归试验,确定其为鸭疫里氏杆菌强毒株,血清凝集试验表明其为血清11型;药物敏感性分析结果显示,该菌对多黏菌素、复方新诺明、庆大霉素、四环素等耐药,对氨苄西林、头孢拉定、头孢唑林等敏感,属于多重耐药菌株;通过基因组高通量测序分析,检测到与表型相关的多黏菌素、红霉素、四环素等相关耐药基因,同时检测到多药外排泵及多药耐药蛋白基因,耐药表型与耐药基因检测结果相符。结果表明,通过高通量测序技术能准确获得鸭疫里氏杆菌分离株抗生素耐药的相关基因信息,对鸭疫里氏杆菌病的临床用药具有一定指导意义。     

渝西地区两株鸭疫里氏杆菌的分离鉴定与药敏试验

为了解重庆西部地区养鸭场鸭疫里氏杆菌血清型的分布及耐药谱,对送检的病死鸭进行了细菌学及病毒学分离鉴定;以参考菌株RA1和RA2制备血清,用玻片凝集试验及琼脂扩散试验鉴别疑似菌株的血清型;采取纸片法进行疑似菌株的药敏试验。结果显示,分离出2株血清型为1型的鸭疫里氏杆菌,分别被命名为YM1和YM2。它们对雏鸭的致病力较强,致死率分别达60%和70%;对头孢类药物、氨基糖苷类及黏杆菌素高度敏感,对四环素类、喹诺酮类、青霉素耐药。上述结果为当地鸭疫里氏杆菌病的防制提供了科学依据。