牛乳源金黄色葡萄球菌生物被膜形成与耐药性的研究

为探讨金黄色葡萄球菌生物被膜形成与耐药性之间的关系,本研究对分离于宁夏地区牛乳腺炎的50株金黄色葡萄球菌进行药敏试验,采用刚果红琼脂法检测金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力,同时用PCR方法对菌株的生物被膜相关基因进行检测。结果显示,金黄色葡萄球菌耐药情况严重,普遍存在多重耐药现象;受试菌株有36株菌(72%)为生物被膜阳性菌株,有14株菌(28%)为生物被膜阴性菌株;受试菌株生物被膜相关基因的检出率分别为icaA(96%)、sarA(76%)、fnbA(100%)、fnbB(100%);生物被膜阳性菌株对大多数抗菌药物的耐药率高于生物被膜阴性菌株,但二者只对克林霉素的耐药率具有统计学意义(P0.05)。本研究结果表明,金黄色葡萄球菌生物被膜的形成机制复杂,生物被膜的形成在金黄色葡萄球菌的耐药性方面起到了一定的促进作用。     

四川省山羊皮下脓肿的流行病学调查及病原体分析

为调查达州、广安、攀枝花、巴中、资阳等四川省主要山羊产业区内的山羊皮下脓肿病的流行病学和致病病原,并对临床分离菌进行药物敏感性评价,以指导合理使用抗生素。在厌氧和常规培养条件下从临床病例中分离细菌,结合细菌的菌落形态和细菌生化特性分析,通过16Sr RNA基因序列分析进行细菌鉴定;测定分离菌的半数致死量(LD50)以判定其毒力强弱;使用CLSI推荐的K-B法进行药敏试验。结果表明,该病以1周岁左右的母山羊在春秋季发病为主,发病率为8.36%~11.27%,平均发病率为9.44%;分离的主要致病菌是伪结核棒状杆菌和金黄色葡萄球菌;其中伪结核棒状杆菌xw2株的LD50为107.5CFU/m L,金黄色葡萄球菌xj5株的LD50为109.7CFU/m L;药敏试验发现这两种分离菌的耐药现象比较普遍,对青霉素和庆大霉素的耐药现象比较严重,但20株伪结核棒状杆菌菌株对环丙沙星、利福平、头孢噻污的敏感率均≥85.00%,14株金黄色葡萄球菌菌株对氨苄西林、左氧氟沙星、利福平的敏感率均≥85.71%。     

河南省猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性及分子分型研究

本研究旨在阐明河南省猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的流行现状及耐药表型特征。从河南省3个规模化养猪场和1个生猪屠宰场共采集1 107份猪鼻腔拭子,采用选择性培养基分离金黄色葡萄球菌与MRSA疑似株,运用多重PCR(扩增16SrRNA、nuc和mecA)鉴定金黄色葡萄球菌和MRSA;以纸片扩散法检测MRSA分离株对19种抗菌药物的敏感性;运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)和葡萄球菌蛋白A(spa)分型方法对MRSA分离株进行分子分型。结果显示,共检出358株金黄色葡萄球菌,分离率为32.3%,其中119株为MRSA,分离率为10.8%,金黄色葡萄球菌分离株中MRSA的阳性率为33.2%。有66.39%的MRSA分离株同时耐受15种抗菌药物,其中出现了喹奴普汀/达福普汀(1.7%)和利福平(0.8%)耐药株,但尚未出现万古霉素和利奈唑胺耐药株。PFGE结果显示,河南省猪群流行的MRSA遗传谱系较为复杂。MLST和spa分型结果显示,该地区猪群流行的MRSA主要为ST9-t899型。研究结果表明,河南省猪群MRSA广泛流行,多重耐药十分严重;流行的猪源MRSA主要为ST9-t899型,但遗传背景呈多样化。本研究结果为加强我国生猪养殖重点地区猪源MRSA的监测和流行传播机制研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌噬菌体SP-2裂菌特性分析

为筛选高效裂解金黄色葡萄球菌的专性噬菌体,有效防控养殖场耐药病原菌感染,本研究采集奶牛场粪水样本,利用实验室培养的金黄色葡萄球菌分离裂解性噬菌体,鉴定分析噬菌体的理化特征和生物学特性,测定裂菌效率及裂菌谱;通过模拟污染地面,研究该噬菌体的环境杀菌潜力。结果显示,分离到1株双链DNA噬菌体SP-2,属于短尾噬菌体科(Podoviridae),裂菌谱广,不仅能裂解实验室耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),而且对食源性及医院临床分离的金黄色葡萄球菌也有很好的裂解作用;在体外杀菌试验中,噬菌体SP-2可在3 h内裂解MRSA菌株PNB25;环境消毒模拟试验结果显示,经噬菌体SP-2喷雾处理后,对平板内细菌的杀菌效率高达90.8%。结论,噬菌体SP-2对金黄色葡萄球菌具有高效、种内广谱的裂解作用,有望成为防控金黄色葡萄球菌感染的一种抗菌制剂及环境消毒剂。     

金黄色葡萄球菌噬菌体SP-2裂菌特性分析

为筛选高效裂解金黄色葡萄球菌的专性噬菌体，有效防控养殖场耐药病原菌感染，本研究采集奶牛场粪水样本，利用实验室培养的金黄色葡萄球菌分离裂解性噬菌体，鉴定分析噬菌体的理化特征和生物学特性，测定裂菌效率及裂菌谱；通过模拟污染地面，研究该噬菌体的环境杀菌潜力。结果显示，分离到1株双链DNA噬菌体SP-2，属于短尾噬菌体科（Podoviridae），裂菌谱广，不仅能裂解实验室耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），而且对食源性及医院临床分离的金黄色葡萄球菌也有很好的裂解作用；在体外杀菌试验中，噬菌体SP-2可在3 h内裂解MRSA菌株PNB25；环境消毒模拟试验结果显示，经噬菌体SP-2喷雾处理后，对平板内细菌的杀菌效率高达90.8%。结论，噬菌体SP-2对金黄色葡萄球菌具有高效、种内广谱的裂解作用，有望成为防控金黄色葡萄球菌感染的一种抗菌制剂及环境消毒剂。     

广东省猪源葡萄球菌耐药性分析及多重耐药基因cfr的流行现状

为了解2013-2017年间广东省猪源葡萄球菌的耐药情况及多重耐药基因cfr的流行现状,采集生猪养殖场和交易市场猪鼻腔拭子分离葡萄球菌,采用琼脂稀释法测定分离菌株对14种抗菌药物的敏感性,并用PCR检测mecA和cfr基因的携带情况。结果显示,在采集的4099份样品中分离到葡萄球菌1485株,其中金黄色葡萄球菌173株。猪源葡萄球菌对红霉素、四环素、泰妙菌素、克林霉素、沃尼妙林和氟苯尼考耐药严重,耐药率分别为91.0%、90.2%、87.7%、84.6%、84.6%及82.0%,对利福平和利奈唑胺相对敏感,未发现万古霉素耐药菌株;庆大霉素、四环素、红霉素和环丙沙星的耐药率呈现逐年上升的趋势。在1485株葡萄球菌中,mecA和cfr的检出率分别为39.9%和12.3%。cfr阳性菌株常携带多种耐药基因,cfr基因的遗传背景也呈现多样化。结果表明,广东省猪源葡萄球菌的耐药情况严重,cfr的检出率高,应加强养殖业中抗菌药物的规范和合理使用,减缓耐药性的产生和传播。     

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌耐药基因型和表型的相关性分析

为研究奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌耐药基因型和表型的分布,并对其相关性进行分析,采用PCR方法对从奶牛乳腺炎乳样中分离的33株金黄色葡萄球菌进行耐药基因检测,采用微量肉汤稀释法测定其对7种药物的敏感性。PCR结果显示,fos A、erm B、erm Cb、aph(3′)-IIIa和lin A/A′基因的检出率分别为51.52%、87.88%、100%、100%和6.06%;未检测到mec A、fos B、fos C、tet M、erm Ab、msr A、msr B、mef A、aac(6′)-Ie+aph(2″)、ant(4′)-Ia、van A、van B、van C1、van C2/3等14种耐药基因。药敏试验结果显示,金黄色葡萄球菌对磷霉素最为敏感,敏感率高达100%,磷霉素可作为临床备用药物;对红霉素的耐药现象最为严重,达到了93.94%;对氨苄西林和克林霉素的耐药率均达到72.73%。相关性分析表明,fos B、fos C基因型和磷霉素耐药表型一致;红霉素耐药占比为93.94%,与erm B基因(87.88%)、erm Cb基因(100%)比较接近。     

耐药基因cfr和optrA在猪源葡萄球菌的流行特征

为了解多重耐药基因cfr、optrA在猪源葡萄球菌中的流行分布,对来自广东省河源市和上海市3个猪场的280份鼻腔拭子样品,使用氟苯尼考(10μg/mL)甘露醇平板进行细菌分离,PCR检测cfr和optrA耐药基因,并通过gap基因进行菌种鉴定,采用琼脂稀释法对16种常用抗菌药物进行药敏试验。结果显示,本研究共分离获得38株葡萄球菌(分离率为13.57%),包括25株cfr阳性菌株(检出率为8.93%)和15株optrA阳性菌株(检出率为5.36%),其中2株葡萄球菌同时检出cfr及optrA基因。gap基因鉴定表明,15株optrA阳性葡萄球菌均为松鼠葡萄球菌,23株cfr阳性葡萄球菌成功分为4个不同葡萄球菌亚种,包括12株松鼠葡萄球菌、8株腐生葡萄球菌、2株马胃葡萄球菌及1株科氏葡萄球菌。药敏结果显示,38株cfr/optrA葡萄球菌均为多重耐药菌株,均对氟苯尼考、克林霉素和泰妙菌素耐药,且对部分药物表现出较高耐药率,如沃尼妙林(94.7%)、氨苄西林(92.0%)及四环素(89.5%),但所有菌株对万古霉素敏感。对比在不同生长阶段分离葡萄球菌中cfr及optrA的检出率,cfr和optrA基因主要流行于育肥猪。结果表明,3个猪场葡萄球菌cfr和optrA的检出率高,耐药情况严重,应加强抗菌药物在养殖过程中规范使用以减缓耐药性的产生和传播。     

鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检测

对分离的20株鸡源致病性大肠埃希氏菌进行药敏试验,筛选出13株耐氧氟沙星(OFL)的菌株,进行质粒提取、电泳和转化试验,获得1株由质粒介导的耐OFL多重耐药菌株.该菌株对参试的11种抗生素全部耐药,其中OFLMIC高于50μg/mL.该菌R质粒电泳可见6条带,转化大肠埃希氏菌DH5α在含20 μg/mL OFL的LB平板筛选得到转化子.该转化子含有原菌株中2.7×103b的质粒,获得原菌株部分耐药性.连续转化5次,均获得耐OFL的转化子,证实该菌株对OFL的耐药性由质粒介导.     

六株鸭疫里默氏杆菌贵州株的分离鉴定及其耐药性分析

鉴定临床症状疑似鸭疫里默氏杆菌病的病原并分析病原耐药性。通过采集临床样本、细菌培养观察、生化试验、16S rRNA基因序列测定及动物感染试验确定6株分离株为鸭疫里默氏杆菌(RA),将其命名为RA-SS1～RA-SS6。药敏试验结果显示,分离菌株仅对头孢氨苄、氧氟沙星、利福平及磺胺异恶唑4种抗生素较为敏感,对其他常用的16种抗生素并不敏感。耐药基因检测结果显示,除arm A、bla(SHV)、bla(CTXM-9G)、erm A、erm B及erm C 6种耐药基因没有扩增出来,oqx A、oqx B、erm F、aph(3′)-Ⅱa、rmt C、aac(6′)-Ⅰb、qnr B、bla(DHA)、bla(OXA)及qnr A 10种耐药基因的检出率分别为100.0%、100.0%、100.0%、83.3%、83.3%、50.0%、50.0%、16.7%、16.7%及16.7%。结果表明:从贵州某养鸭场分离出6株RA;各分离株具耐12种以上抗生素高达100.0%,1株RA可同时耐17种抗生素,分离株对常用抗生素具有不同程度的多重耐药性;首次报道在RA分离菌株上检测出16S rRNA甲基化酶及β-内酰胺类耐药基因,RA分离菌株携带多种耐药基因。细菌耐药表型与耐药基因检出率关系紧密且在一定程度上呈正相关。本研究为RA的鉴定、治疗及其耐药机制的研究提供了科学依据。     

桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜及icaA表达的抑制作用

为研究桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜及icaA表达的抑制作用,用微量肉汤稀释法测定桃柁酚对10株金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,并利用激光共聚焦显微镜观察桃柁酚抑制生物膜的情况;通过实时荧光定量RT-PCR技术检测桃柁酚对细菌生物膜形成过程中相关基因的水平变化;采用斑点免疫印迹法检测细胞间多糖黏附素在生物膜形成过程中的作用。结果显示,桃柁酚对金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜的最小抑菌浓度值范围分别为1～2μg/mL和4～16μg/mL;能杀灭和清除已形成的生物膜;桃柁酚可通过影响agr和sar调控系统,抑制细胞间多糖黏附素合成基因icaA的表达进而抑制细胞间多糖黏附素的合成。表明桃柁酚能有效抑制金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜,是一种抑制金黄色葡萄球菌生物膜的有效药物。     

2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析

为掌握广西猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻样品,应用RT-PCR方法进行检测,并随机选取部分PEDV阳性样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果显示,共获得PEDV S基因序列23株、M基因和N基因序列各25株。同源性分析显示,广西流行毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因为90.6%~100%和89.6%~100%,在M基因为97.0%~100%和96.9%~100%,在N基因为95.9%~100%和95.9%~100%。序列比对显示,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、突变和插入现象,且各毒株之间存在差异。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株主要分布在S基因的GⅠb、GⅡa亚群,M基因的GⅡa、GⅡb亚群,N基因的GⅢ亚群。遗传进化速率测算显示,广西流行毒株及国内外参考毒株S、M、N基因的平均进化速率分别为7.39×10-4、1.43×10-4和2.96×10-4substitutions/site/year,S基因的变异速度最快。表明PEDV广西流行毒株存在遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。     

鸭疫里氏杆菌鸭源致病性大肠埃希氏菌和鸭沙门菌的RAPD研究

以 4株不同血清型的鸭疫里氏杆菌、5株不同血清型的鸭源致病性大肠埃希氏菌和 5株同一血清型的鸭沙门菌为研究对象 ,分别提取基因组DNA ,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行了分析。结果 ,从 2 0条随机引物中筛选出了 38条能在这 3种菌中有较好多态性的随机引物 ,8个有效引物共扩增出了 10 2个DNA片段 ,其中 14个菌株共有的谱带仅有 1条 ,显示多态性的片段有 10 1个 ,占 99.0 % ;对RA的 4个菌株扩增出的谱带数为 5 1条 ,共同片段有 12条 ,多态性片段 39条 ,占 76 .5 % ;对沙门菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 6条 ,共同片段为13条 ,多态性片段 33条 ,占 71.7% ;对大肠埃希氏菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 8条 ,共同片段 4条 ,多态性片段 4 4条 ,占 91.7%。在 8条引物中进一步筛选出 1条引物G12 ,其图谱中 5 35bp的条带为鸭疫里氏杆菌所特有 ,330bp的条带为沙门菌所特有 ,12 2 7bp的条带为大肠埃希氏菌所特有 ,表明G12可作为分子标记用来鉴别这 3种细菌。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎 (IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒 (NIBV)W株 ;再通过SPF鸡胚连续传代 ,获得了NIBV疫苗毒株W93;继而借助RT PCR法扩增了其S1基因 ,并测定了S1基因的核苷酸序列 ,分析了与相关毒株间的同源性。结果显示 ,W93株在鸡胚中的病毒产量达 10 7.8EID50 /0 .1mL ,适用于所有日龄的雏鸡 ;W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M4 1株、H52 株和H12 0 株的同源性很高 ,分别为 96 .9%、96 .8%和 97.1%。表明 ,W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株     

鸡传染性支气管炎病毒SY毒株生物学特性及其S1基因分子遗传变异分析

通过生物学特性研究 ,验证了分离自沈阳地区的SY毒株确实为 1株鸡传染性支气管炎病毒。病毒中和试验表明 ,SY血清型不同于参考毒株T、H52 、M41及国内其他流行株如HD、XB、DB等 ;S1基因序列分析表明 ,SY核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M41、H12 0 、N1 62、Gray、6/ 82和Ark99等毒株的同源率都低于 80 % ,进化关系与各参考毒株也相距甚远 ,糖基化位点出现 3个新位点 ,氨基酸疏水性区域也存在差异。     

猪和野生动物源大肠杆菌及沙门菌中磺胺类药物耐药基因的检测

对从四川省10个规模化猪场和16种野生动物的粪样中分离鉴定出的67株大肠杆菌、57株沙门菌进行了药敏试验。结果,猪源和野生动物源分离菌对磺胺类药物的耐药率分别为72.0%(72/100)和29.2%(7/24)。根据GenBank中登录的序列,设计了3对特异性引物,对磺胺类药物的耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了三重PCR检测。在这124株细菌中,Sul1基因的检出率最高,为47.6%(59/124),Sul2基因的检出率为17.7%(22/124),Sul3基因的检出率为18.5%(23/124)。药敏试验结果与基因检测结果的符合率为89.9%。     

禽大肠埃希氏菌融合菌株疫苗的研制及应用

对从陕西省主要养鸡地区病死鸡分离的禽致病性大肠埃希氏菌进行Omp分型 ,用不同Omp型的菌株构建成融合菌株。用融合菌株制作铝胶灭活疫苗 ,与单价疫苗和两亲本菌株双价疫苗的免疫保护效果进行比较。结果表明 ,融合菌株疫苗可对多种O血清型致病性大肠埃希氏菌的攻毒试验产生坚强的保护 ,保护率高达 93%～ 10 0 % ,而O血清型单价疫苗的保护率仅 6 7%～80 % ,双价疫苗的保护率仅 80 %。在生产中对蛋用鸡的应用结果表明 ,融合菌株疫苗可明显降低鸡的死淘率。     

乳牛乳腺炎多联疫苗的研制及其临床应用效果

从全国各地奶牛场采集的256份临床型乳腺炎病乳中分离鉴定出了13株金黄色葡萄球菌、32株无乳链球菌和27株停乳链球菌;采用血清学交叉免疫试验,筛选出了毒力及交叉免疫原性强的3种菌的优势菌株。采用这些菌株和一系列新工艺和新方法,研制出了乳牛乳腺炎灭活多联疫苗。建立了用奶山羊进行制苗菌株毒力复壮及用ELISA进行抗体检测的方法,进行了免疫剂量及注射部位的筛选试验以及疫苗安全性、免疫持续期、效力及田间扩大试验。结果表明,该灭活多联疫苗对乳牛具有安全高效的特点,经肌肉或后海穴免疫1次,每次5mL,免疫持续期可达4个月;且后海穴的免疫效果优于肌肉注射,可使临床型乳腺炎发病率降低49.22%~59.86%。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。