禽多杀性巴氏杆菌亚单位成分的免疫原性研究

禽多杀性巴氏杆菌是禽霍乱的病原,该病对养禽业危害较大,目前尚无理想的免疫制剂。学者们在筛选弱毒苗和研制灭能苗的同时,在研制禽多杀性巴氏杆菌亚单位苗方面作了一些尝试,为禽霍乱的免疫研究开辟了一条新路。本文就其亚单位成分的免疫原性、诱导产生保护作用及血清学反应等加以阐述。     

兔巴氏杆菌病免疫的研究

兔巴氏杆菌病(即兔出血性败血病,简称兔出败)目前流行严重,对养兔业危害较大。为防制其流行,国内外有关学者就本病免疫问题开展了研究。但国外报道的甲醛灭能苗和油佐剂菌苗,效力都欠佳,美国CU弱毒株对兔不安全;国内试制的甲醛灭能苗虽有一定效力但也不理想。为此,我们开展了兔巴氏杆菌弱毒冻干菌苗的研究,利用禽霍乱弱毒Pc株,试制成冻干菌苗,对兔进行了安全、效力等项试验,初获满意结果。     

禽霍乱荚膜多糖菌苗的研究——菌苗制造与品质测定

禽霍乱(Fowl Cholera)是当前危害养禽业发展的重要疫病之一。由于引起该病的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的抗原结构极为复杂,免疫机制不甚清楚。我们于1981年对禽源多杀性巴氏杆菌的荚膜物质的免疫原性进行了初步研究,证实多杀性巴氏杆菌的荚膜物质具有良好的抗原性,是建立特异性免疫的重要物质。并于1982年在对研制本菌苗所使用的菌种、提取荚膜物质的方法、筛选适当的佐剂等研究的基础上,进一步对本菌苗的制造工艺流程、质量检测进行了研究。     

禽多杀性巴氏杆菌荚膜多糖—蛋白复合物对鸭的安全性和免疫原性试验

禽霍乱又称禽出败,是由多杀性巴氏杆菌引起的禽类的一种急性败血性传染病。对养禽业危害较大。我国迄今虽研制出多种禽霍乱灭活苗和弱毒苗,对控制本病流行起到了一定的作用,但安全性、稳定性及免疫期仍不够理想。多年来国外对禽巴氏杆菌荚膜抗原     

28株禽源多杀性巴氏杆菌热浸抗原的分型研究

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)是禽出血性败血症(即禽霍乱)的病原体,其抗原结构甚为复杂。中国兽药监察所以及河北、四川、吉林、广东等地对我国禽源多杀性巴氏杆菌的K、O抗原进行了大量的分析研究,确认我国各地绝大多数的禽源多杀性巴氏杆菌的O抗原为5,K抗原为A,( 5:A),但利用琼脂扩散法(Agar diffusion method)鉴定禽源多杀性巴氏杆菌的热浸抗原的分析研究,报道较少。我们参考Heddleston的研究方法,对28株禽源多杀性巴氏杆菌进行了琼扩分型鉴定,以了解我国禽源多杀性巴氏杆菌的血清型,为进一步研究各种分型方法的关系以及为研制理想的禽霍乱菌苗提供理论根据。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果分析

为探讨禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果,利用PCR技术扩增了禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因片段,并克隆入pcDNA3.1(+),构建了DNA疫苗pcDNA-OMPH(pOMPH)、pcDNA-OMPA(pOMPA)和pcDNA-OMPH/OMPA(pOMPHA),将其体外转染SP2/0细胞,用间接免疫荧光试验检测其表达情况。同时以弱毒活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)和PBS作为阴性对照,分别免疫4周龄鸡,检测血清特异性抗体水平、外周血淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况,经强毒攻击后计算各疫苗的保护率。结果显示,融合DNA疫苗组血清抗体水平与弱毒活疫苗相当,明显高于单价DNA疫苗(P<0.05);pOMPHA组的刺激值(SI值)和IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05),单价DNA疫苗组略高于弱毒活疫苗组;强毒攻击后各DNA疫苗均可为动物提供一定的保护力,其中融合DNA疫苗的保护率最高,可达86.7%,其次为弱毒活疫苗,为73.3%,而单价DNA疫苗则低于弱毒活疫苗,仅为60%和66.7%。结果表明,DNA疫苗尤其是融合DNA疫苗在预防禽多杀性巴氏杆菌病(禽霍乱)方面具有较好的应用前景。     

禽霍乱改进型灭活苗的研制

用禽源多杀性巴氏杆菌Ｃ４８－１强毒株接种１日龄雏公鸡，制取肌肉脏器菌液，与Ｃ４８－１肉汤培养菌液按一定比例混合，制备成禽霍乱氢氧化铝胶灭活苗。攻毒试验表明，该苗对异型菌株Ｐ１０５９及从皖中西部地区分离的禽巴氏杆菌强毒株均有１００％保护力。     

禽霍乱弱毒菌株的研究——PTR株及PC株主要特性的研究

从41株禽霍乱强毒菌株中,挑选出3株供致弱用菌株。经用不同方法致弱后,从致弱的菌株中挑选出用高温传代培养法致弱的PTR株及在含洗涤剂的培养基上传代致弱的PC株。 为了对所培育的二弱毒菌株的主要特性有一比较明确的认识,从而为进一步应用二弱毒菌株制备菌苗进行免疫试验提供必要的依据,进行了有关的各项试验研究。     

禽多杀性巴氏杆菌交叉保护因子的研究

禽多杀性巴氏杆菌交叉保护因子存在活鸡体培养物中。本文用鸡 活体培养禽多杀性巴氏杆菌C_(48-1)强毒株(血清1型),在菌血症时采血经 差速离心收获细菌,制成的死菌苗对异型菌株C_(44-42)(血清3型)和P_(1059) (血清3型)攻毒产生交叉保护作用。而41℃肉汤培养的C_(48-1)菌株则不具有这种交叉保护作用。 活体培养的细菌经冻融、溶菌酶、透明质酸酶、DN_(ase)、EDTA、Triton X-100等处理溶解后,细菌溶解物对异型菌株保护率达100％,而其溶解物的上清和沉淀时异型菌株保护率也达66.7％及80％。而溶解物沉淀经蛋白酶处理后,则失去了交叉保护能力,说明产生交叉保护作用的交叉保护因子(CPF)可能是蛋白质。 生化分析表明,活体培养的禽多杀性巴氏杆菌和肉汤培养的禽多杀性巴氏杆菌其物质含量是不同的。活体培养的细菌溶解物含CPF,其蛋白与糖含量比(P/C)为3.97:1,而肉汤培养的细菌P/C为1.01:1。SDS-PAGE分析表明,有一分子量在17200～30000之间的蛋白成分仅存在于活体培养的细菌中,经测算其分子量大约为19320。这些研究表明,分子量为19320的蛋白质可能就是存在于活体培养物中的交叉保护因子。     

禽巴氏杆菌免疫鸡IgG、IgM消长规律的研究

本试验利用鸡血清中主要有IgG、IgM(IgA主要在粘膜),和2-基巯乙醇可破坏IgM的理论,以间接血凝法检测禽霍乱731、GNCoⅡ弱毒苗免疫鸡和C_(48-1)强毒接种后发病治愈鸡(即模拟禽霍乱强毒感染鸡)的IgG、IgM消长规律。结果抗体中主要有IgM;当强毒攻击后,三个组均无回忆反应的迹象,其抗体中仍是IgM占优势。对731、GNCo Ⅱ和C(48-1)的荚膜粗提物中多糖与蛋白成分的分析表明,多糖是蛋白的15.35倍以上。荚膜在菌体外层,与机体紧密接触,又为TI抗原,易刺激机体产生IgM,因此产生IgM占优势是巴氏杆菌本身结构块定的。然而如将荚膜抗原与某蛋白载体结合后转变成TD抗原,即可诱导机体产生IgG和回忆反应,这样免疫期可望能延长。目前研制的多种禽霍乱弱毒苗免疫期较短,本试验人工模拟强毒感染康复鸡的免疫期亦较短,从试验结果看出,由于禽霍乱菌免疫主要产生IgM,很少产生IgG,而IgM比IgG消失快的特点及无回忆反应的特点,初步认为是禽霍乱菌免疫期短的原因。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1成熟外膜蛋白H重组亚单位设苗免疫效果的研究

将融合表达禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H(OmpmH)的重组菌pGEX-ompmH/BL21大量培养,在最佳诱导条件下诱导表达,表达产物经蛋白酶剪切及亲和层析纯化,得到OmpmH基因的原核表达产物,将其与弗氏完全佐剂混合制成油乳剂亚单位疫苗,用该疫苗肌肉注射接种5周龄鸡,首免后每周采血检测抗体,二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击.结果显示,OmpmH具有良好的免疫原性,能诱导鸡体产生特异性抗体,可抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击,免疫效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗.     

禽多杀性巴氏杆菌C_(48-1)成熟外膜蛋白H重组亚单位疫苗免疫效果的研究

将融合表达禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H(OmpmH)的重组菌pGEX-ompmH／ BL21大量培养,在最佳诱导条件下诱导表达,表达产物经蛋白酶剪切及亲和层析纯化,得到Ompm H基因的原核表达产物,将其与弗氏完全佐剂混合制成油乳剂亚单位疫苗,用该疫苗肌肉注射接种5周龄鸡,首免后每周采血检测抗体,二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1 进行攻击。结果显示,OmpmH具有良好的免疫原性,能诱导鸡体产生特异性抗体,可抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击,免疫效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗。     

禽霍乱SX-3号菌菌苗的研制

笔者于1985～1987年,先后从5个爆发禽霍乱的鸡场采取病鸡的肝、脾脏,分离野毒株,并筛选出具有免疫原性的菌株作为制苗菌种,制备菌苗,用于预防区域性发生的禽霍乱,效果良好。 (一)方法和结果 1.分离菌株:从刚死亡鸡采取肝、脾组织,用血液平板划线分离培养,并同时用马丁肉汤进行增菌。培养24小时后,挑选可疑为巴氏杆菌的菌落作纯培养。用马丁肉汤培养物对小白鼠作致病性试验;皮下注射0.2ml,多数于26～48小时死亡。从中挑选出致病力强的4株菌Sx-1、Sx-2、Sx-3和Sx-4号,进行鉴定。     

布氏杆菌猪型二号菌苗对牦牛不同途径免疫效力观察

近年来,国内应用布氏杆菌羊型五号菌苗和猪型二号菌苗预防家畜布氏杆菌病基本控制了羊牛布氏杆菌病的流行。但对牦牛布病免疫进展不大,报道甚少。为此,我们开展了牦牛布病免疫途径的研究,用中国兽药监察所培养的布氏杆菌二号弱毒菌苗,对牦牛进行气雾、注射和口服三种不同途径的免疫效力观察。     

禽霍乱油乳剂苗的研究

禽霍乱至今在很多国家仍是一种尚未控制的重要禽病。为了控制和消灭本病,我们于1979～1984年开展了禽霍乱油乳剂苗的研究。 材料与方法 (一)制苗菌株 从梅河口市不同地区分离出31株野毒中筛选出3株典型的多杀性巴氏杆菌。制苗前分别连续通过鸡3代,无菌采取鸡心血接种于含0.1％裂解血和4％健马血清马丁琼脂平板,选典型菌落作为制苗用菌种。     

对禽霍乱731弱毒菌苗在使用中发生不安全反应的调查

吉林省于1986年春防中应用吉林省兽药厂生产的禽霍乱731弱毒菌苗,15个县、市发生了强烈的不安全反应,致使部分鸡只死亡。为调查事故的原因,我们应邀会同哈尔滨兽医研究所和吉林省畜牧局等单位的同志进行了调查。 (一)菌苗发生不安全反应的情况 据吉林省畜牧局介绍,在春防中使用吉林省兽药厂生产的禽霍乱731弱毒菌苗在全省15个县、市(区)按每羽5000万个活菌的剂量免疫,注射128万余只鸡,结果发生较强烈的反应。全省3月初开始防疫,注射后第2天大部分鸡不食,缩颈闭眼似睡,离群喜卧,部分鸡冠、肉垂发紫,拉稀呈黄绿色,呼吸困难,产蛋率显著下     

间接血凝试验检测鸡血清中多杀性巴氏杆菌抗体

近几年来,国内外对禽多杀性巴氏杆菌(Pas-teurella multocida)的免疫应答研究表明,体液免疫和细胞免疫在抵抗巴氏杆菌的再感染均有重要的作用。并应用试管凝集反应、间接血凝(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等检测多杀性巴氏杆菌免疫后鸡和火鸡的血清抗体,并认为此3种方法所检出的抗体滴度与对抗强毒的保护作用一致。本研究优化了检测鸡血清抗体的IHA试验及抗原制备的条件,并比较了IHA滴度与攻毒保护的关系。(一)材料和方法1.菌种:中国兽医药品监察所保藏的C_(48)-1强毒菌株,用前通过小白鼠3代,鸡1代复壮,然后接种于血液马丁肉汤或血液马丁琼脂培养,培养移植不超过3次,菌液10~(-8)稀释0.1ml(含2～     

家兔巴氏杆菌病免疫的研究——PC弱毒株冻干菌田间免疫试验

用巴氏杆菌PC弱毒株试制的冻干菌苗(以下简称PC冻干苗)已对家兔进行了安全性、免疫原性、稳定性、效力及免疫期等一系列试验获得了比较满意的结果,在此基础上又进行了田间免疫试验,现将试验结果报告于下: 试验材料 (一)试验动物 ①兔:实验室用的肉兔有成、年青紫蓝兔、日本大耳兔、中国本兔;     

鸡IL-18对禽多杀性巴氏杆菌DNA疫苗的免疫佐剂作用

为了探索鸡IL-18在禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗中的免疫佐剂作用,分别用共表达鸡IL-18基因和禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗、鸡IL-18真核表达质粒pcDNA3/cIL-18与禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗混合物、禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗肌肉注射5周龄鸡,首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击。结果鸡IL-18能够明显增强禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗的免疫原性,显著提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平,并且鸡IL-18与禽多杀性巴氏杆菌H基因共表达时的免疫佐剂作用最强,能强有力地抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击。结果表明,鸡IL-18可作为DNA疫苗的一种理想的免疫佐剂。     

禽多杀性巴氏杆菌C_(48—1)染色体基因文库的构建

本文以Cosmid作载体,用细胞株SMRIO制备包装细胞,运用体外重组和体外包装技术,构建了禽多杀性巴氏杆菌C_(48-1)染色体基因文库。每微克染色体DNA可获得1000～2000个转导子。为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌的基因特性和筛选某些基因或者克隆与表达抗原有关的基因打下了基础。