鹳源产气荚膜梭菌的分离及其生化特性鉴定

从病死鹳的肝和肠分离出疑似产气荚膜梭菌,纯化后进行革兰染色、生化试验、16S rDNA基因序列分析和毒素鉴定、动物试验及药敏试验。结果表明,分离的菌株为革兰阳性杆菌,能够发酵甘露糖和麦芽糖等糖类,不能发酵棉子糖和甘露醇;16S rDNA基因序列分析确定为产气荚膜梭菌序列;多重PCR结果显示,该菌仅含有α毒素基因,因而确定分离菌为A型产气荚膜梭菌。动物试验结果显示,将该产气荚膜梭菌灌服鸡48 h后,鸡肠道有较多出血点,但未表现坏死性肠炎症状。药敏试验结果显示,该菌对阿莫西林、头孢哌酮、氟苯尼考、美洛西林等药物敏感,对多黏菌素B、链霉素、卡那霉素等药物不敏感,对环丙沙星和庆大霉素中敏。     

贵州某猪场胸膜肺炎放线杆菌血清5型的分离鉴定

2020年11月贵州毕节某猪场一头经产母猪突然发病死亡,为鉴定导致其发病死亡的致病菌,试验无菌采取病死猪病变肺组织,通过细菌分离培养、染色镜检、生化试验、16S rRNA PCR扩增等方法进行鉴定,并对分离菌进行药敏试验、血清型鉴定、毒素基因鉴定、耐药基因检测及毒力试验。结果显示,从病变肺中分离到1株病原菌,分离菌的菌落形态、菌体形态、生化特征和16S rRNA基因序列均与胸膜肺炎放线杆菌相符,将其命名为APP GZBJ2020;药敏试验显示,APP GZBJ2020株对头孢曲松、头孢哌酮、青霉素等9种药物敏感,对头孢氨苄和米诺环素中度敏感,对庆大霉素、红霉素、新霉素等9种药物耐药;血清型鉴定结果显示其为血清5型胸膜肺炎放线杆菌;毒素鉴定结果显示APP GZBJ2020株含有ApxⅠ、ApxⅡ及ApxⅣ三种毒素基因;耐药基因检测结果显示,APP GZBJ2020株携带有tem、gyrB、parC和parE四种耐药基因;动物毒力试验结果显示,APP GZBJ2020株对小鼠有致病性。试验成功从病死经产母猪病变肺中分离到1株血清5型胸膜肺炎放线杆菌,试验结果可为该猪场治疗发病猪提供一定帮助,并为了解胸膜肺炎放线杆菌在贵州省的流行血清型提供数据支持。     

牛源纹带棒状杆菌的分离鉴定及其耐药基因与agr管家基因的检测

首次于牛鼻拭子中分离得到1株优势菌株,经16S rRNA鉴定该菌为纹带棒状杆菌。动物回归试验、小鼠致病性试验结果显示,该菌具有一定的条件致病性。药敏试验与耐药基因检测结果显示,该菌四环素耐药基因与大环内酯类药物耐药基因均呈显性表达。PCR检测结果显示,该纹带棒状杆菌存在毒力相关基因——agr管家基因(accessory gene regulator)。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对云南某鸡场发生鸡急性死亡的疑似禽霍乱病例进行病原确诊,无菌采集送检死鸡肝脏组织进行细菌分离培养、生化鉴定、细菌16S rRNA基因分析及荚膜分型鉴定,对分离菌株进行耐药性、致病性分析。结果,该分离菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌;药敏试验表明,分离菌对头孢氨苄、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林等8种药物敏感,对大观霉素、复方新诺明等6种药物中度敏感,对卡那霉素、链霉素、四环素等12种药物耐药;耐药基因检测显示,该分离株仅含有磺胺类sul2基因和四环素类tetB基因;动物试验表明,接种500 CFU的45日龄鸡在接种后7 d内全部死亡,接种12.5 CFU的小鼠在接种后48 h内全部死亡,死亡小鼠病理组织切片显示各器官均有不同程度的病变。上述结果表明,该分离株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株,是该鸡场发生疫情的病原。本研究结果为我国鸡源多杀性巴氏杆菌的遗传特性研究提供了基础资料。     

大熊猫源普通变形杆菌分离鉴定及致病性分析

为探明福州某患病大熊猫的病因,研究病原菌的生物学特性、药物敏感性及致病性,从患病大熊猫的粪便中分离、纯化病原菌,经培养特性、形态学观察、生化试验及16S rRNA PCR扩增、测序及进化树分析等系统鉴定,并对鉴定菌进行药敏试验、动物致病性试验、组织病理学观察及毒力因子检测。结果分离到1株具有迁徙生长特点的革兰阴性杆菌,生化特性与普通变形杆菌(Proteus vulgaris)相一致,16S rRNA基因序列与普通变形杆菌的相似性为99.9%,进化树分析显示,与普通变形杆菌处于同一分支,确定分离菌为普通变形杆菌,命名为GP19株。该分离菌至少携带ureC、mrpA、fli L、flhA、flhB、flhD和pmbA等7种毒力基因,小鼠腹腔接种后12 h内死亡,半数致死量(LD50)为9.73×106CFU/m L。病理切片观察可见肝、脾、肺、肾、脑等实质器官淤血、出血,十二指肠肠绒毛大量坏死、脱落。药敏试验表明,该菌对环丙沙星、头孢克肟和氨曲南等23种药物敏感,对林可霉素、强力霉素和头孢唑啉等13种药物耐药。以上研究表明,患病大熊猫粪便中存在携带多种毒力因子的普通变形杆菌,并表现出较强的致病力,可损伤肝、脾、肺、肾、脑及十二指肠等多个组织器官,对临床药物显示多重耐药,本研究结果为大熊猫的疫病防控提供了科学依据。     

牛产气荚膜梭菌病自然病例的病理学观察

牛产气荚膜梭菌病是由产气荚膜梭菌引起的条件性高度致死性传染病 ,其特征是发病急 ,病程短 ,死亡快。本病病原血清型主要是A型 ,也有C型和D型。 2 0世纪 90年代 ,该病在我国频繁发生 ,给养牛业造成较大经济损失。为探讨本病的病理变化特征和发展规律 ,给诊断该病提供科学依据 ,笔者对病原分离鉴定为产气荚膜梭菌的自然病死牛的组织病理学变化进行了观察。1　材料和方法1.1　病料采集　对经流行病学调查、临床症状观察疑似产气荚膜梭菌病的自然病死牛立即解剖 ,无菌采集肝、脾、肠系膜淋巴结以及病变小肠 15cm以上 ,系统观察各实质脏器的…     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对云南某鸡场发生鸡急性死亡的疑似禽霍乱病例进行病原确诊。无菌采集送检死鸡肝脏组织进行细菌分离培养、生化鉴定、细菌16S rRNA基因分析及荚膜分型鉴定，对分离菌株进行耐药性、致病性分析。结果，该分离菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌；药敏试验表明，分离菌对头孢氨苄、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林等8种药物敏感，对大观霉素、复方新诺明等6种药物中度敏感，对卡那霉素、链霉素、四环素等12种药物耐药；耐药基因检测显示，该分离株仅含有磺胺类sul2基因和四环素类tetB基因；动物试验表明，接种500 CFU的45日龄鸡在接种后7 d内全部死亡，接种12.5 CFU的小鼠在接种后48 h内全部死亡，死亡小鼠病理组织切片显示各器官均有不同程度的病变。上述结果表明，该分离株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株，是该鸡场发生疫情的病原。本研究结果为我国鸡源多杀性巴氏杆菌的遗传特性研究提供了基础资料。     

团头鲂致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定长春市某水产养殖场团头鲂的病原菌,从患病团头鲂体内分离到致病菌JWC086,对其形态和生理生化特性进行了鉴定,并对16S r DNA和管家基因gyr B序列、毒力基因携带情况及耐药性进行了分析。结果显示,该菌为革兰阴性菌,其生理生化特性与维氏气单胞菌基本相同。16S r DNA序列比对结果表明,该菌与维氏气单胞菌(KP716691)的同源性在99%以上。基于16S r DNA与gyr B序列的进化分析显示,该菌与维氏气单胞菌同属一个分支,同源性较高。将分离菌人工感染团头鲂,7 d内团头鲂全部死亡,且临床症状与自然病例相似。通过毒力基因检测发现,能从JWC086扩增出气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、丝氨酸蛋白酶(ser)、核酸酶(exu)、脂肪酶(lip)及密度感应系统调控基因(Lux S)等7种毒力因子。药敏试验结果显示,该菌对氟苯尼考及复方新诺明等药物比较敏感。本研究为团头鲂感染维氏气单胞菌的鉴定及治疗提供了科学依据。     

鸡产气荚膜梭菌遗传多样性的REP-PCR分析

为探讨鸡产气荚膜梭菌流行现状的调查方法,采用REP-PCR(repetitive extragenic palindromicPCR)技术对四川省10个规模化鸡场分离得到的34株A型产气荚膜梭菌进行了遗传多样性分析,并与AFLP(amplified fragment length polymorphism)方法进行了分型比较.结果显示,尽管REP-PCR分型方法只能将34株产气荚膜梭菌分为7个亚型,但是,仍然表现出对产气荚膜梭工菌菌株的较高的鉴别能力,不失为一种简便、快速、可靠的产气荚膜梭菌分型方法.经对亚型分布情况进行分析.表明产气荚膜梭菌的流行特点与地区差异相关,不同鸡场产气荚膜梭菌的亚型差异明显,而同一鸡场的亚型较单一,以一种亚型为主,交叉有少数其他亚型;优势基因型为REP-PCR基因1型、2型和3型.证实,REP-PCR技术适用于鸡产气荚膜梭菌遗传多样性分析.     

产气荚膜梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与鉴定

提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA,经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段,将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中,并转化至大肠埃希氏菌JM109中;经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析、PCR鉴定和Southern blotting检测,表明该重组质粒是产气荚膜梭菌α 毒素基因的克隆。     

岩羊病原性大肠埃希氏菌及A型产气荚膜梭菌的分离与鉴定

从1只突然死亡的1月龄雄性岩羊体内分离到1株病原性大肠埃希氏菌和1株A型产气荚膜梭菌,经毒力试验测得大肠埃希氏菌LD50为4.4×108CFU,A型产气荚膜梭菌LD50为6.1×109CFU,同时进行了药敏试验,为今后预防和诊疗提供理论基础.     

团头鲂致病嗜水气单胞菌的分离鉴定与毒力基因的检测及耐药分析

为鉴定长春市某水产养殖基地患病团头鲂(Megalobrama amblycephala)病原菌,本研究从患病鱼中分离出致病菌WC03株,经人工感染试验鉴定该病菌有较强的致病性,能使团头鲂、小鼠及斑马鱼致病死亡,之后对分离菌株WC03进行形态学、理化特性分析,初步判定该菌为嗜水气单胞菌。进一步使用分子生物学方法检测该菌16S r DNA和gyr B、rpo D和cpn60这3种管家基因,同时对该菌的致病性及毒力基因携带情况进行分析。结果显示,16S r DNA及管家基因系统进化分析表明,该菌与嗜水气单胞菌聚类,且同源性在98%以上。该菌含有气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(aha)、丝氨酸蛋白酶(Ser)、核酸酶(exu)、脂肪酶(Lip)及密度感应系统调控基因(Luxs)这7种毒力因子。药敏试验结果表明,该菌对呋喃妥因、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢呋辛这4种药物高度敏感。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为确定黑龙江省2个规模化奶牛场犊牛急性呼吸道感染的病因,笔者进行了病原的分离纯化,细菌16S rDNA基因和多杀性巴氏杆菌特异性基因OmpH鉴定、生化试验、药敏试验、半数致死量试验、荚膜血清型分型及22种毒力因子的检测,以确定主要病原的种类、型别及生物学特性。结果表明,从死亡牛肺和患病牛鼻拭子分离的2株病原菌均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,分别被命名为WC16551和LY01,序列分析结果表明,其与牛源多杀性巴氏杆菌同源性达到99%以上。药敏试验显示2株菌均对恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。半数致死量结果表明,LY01菌株的毒力明显强于WC16551菌株,2株分离菌均携带19种毒力因子,未检出hgbB、toxA和nanB三种基因。上述研究结果表明,导致2个牛场发病的主要病原菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。     

产气荚膜梭菌β毒素和ε毒素以及腐败梭菌α毒素三联基因工程灭活疫苗的制备与免疫效力评价

为了获得高表达量的重组C型产气荚膜梭菌β毒素,鉴定其致死性和反应原性,并评价其与D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素共表达产物联合制成三联基因工程灭活疫苗的免疫保护效力。设计含不同酶切位点的2对引物,PCR扩增C型产气荚膜梭菌β毒素基因cpb1和cpb2,将二者克隆至pRSFDuet-1质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3),自诱导培养基诱导2段基因共表达。用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清和中和试验对表达产物进行鉴定。将诱导收获的大肠杆菌以及D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的共表达产物1∶2配比灭活制成三联灭活铝佐剂疫苗,以每只1 m L剂量皮下免疫家兔2次后,测定血清中和抗体效价,用1 MLD的C、D型产气荚膜梭菌毒素和腐败梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的重组大肠杆菌BL21(pRSFDuet-cpb1-cpb2)能够表达重组β毒素,产物能够与C型产气荚膜梭菌抗毒素血清反应,且具有小鼠致死毒性,抗毒素血清可以将其毒性中和;制成联合疫苗免疫家兔,免疫血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为8 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为45 MLD/0.1 m L,对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为1.5 MLD/0.1 m L;用3种毒素攻击免疫组家兔均全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015版)》效力检验标准。本研究为羊猝狙、肠毒血症和快疫三联疫苗的研制提供了试验基础。     

犬产气荚膜梭菌的分离和PCR检测方法的建立

从 12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了 18株病原菌 ,经生化试验及毒素中和试验 ,确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列 ,设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和 β2共 6对分型毒素基因的引物 ,对以前昆明地区分离的 1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增 ,结果扩增出了与预期大小相同的 6个基因片段 ,分别为 2 33、196、32 4、4 46、5 6 7和 6 6 5bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型 ,较细菌毒素检测方法快速 ,与细菌分离鉴定的结果一致。     

致狐狸眼炎大肠杆菌的生物学特性检测与致病性分析

为确定辽宁省某狐狸养殖场致患病狐狸眼炎的病原菌,从患病狐狸眼部分离病原菌,并对分离株进行形态观察、生化试验、16S rRNA基因序列测定、血清分型及进化分群,在此基础上完成了毒力基因检测、药敏试验以及人工感染小鼠试验等。镜检结果显示,该细菌为革兰阴性短杆菌,最终鉴定结果可以确定此分离株为O25型大肠杆菌,并且2株菌均属于系统发育群B2群。毒力基因检测结果显示,其含有CNF-Ⅰ基因,无LT、K99、STa、SLT-Ⅰ、CNF-Ⅱ及EAE等毒力基因。人工感染小鼠试验显示,2株分离菌株均可引起小鼠眼睛发炎,化脓等疾病,其对小鼠的半数致死量(LD50)分别为3.60×10~6CFU/只、1.79×10~6 CFU/只。药敏试验表明,其对庆大霉素、环丙沙星、黏菌素及氯霉素耐药性较强,但对头孢噻肟、磺胺甲恶唑、四环素、左氧氟沙星、氟苯尼考及大观霉素等抗生素较为敏感。本研究结果为临床治疗由大肠杆菌引起的狐狸眼炎提供了重要依据。     

鲫鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

为鉴定长春市某渔场鲫鱼病原菌,从患病鲫鱼脾中分离到病原菌J YX-1,通过生理生化试验,16S rRNA、管家基因及毒力基因扩增,系统发育分析和药敏试验进行鉴定。结果显示,分离菌J YX-1对鲫鱼具有致病性;基于16Sr RNA与4种管家基因构建的系统发育树显示,该菌与维氏气单胞菌同属一个分支,亲缘关系较近,表明J YX-1为维氏气单胞菌;毒力基因检测发现,能从J YX-1扩增出气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、丝氨酸蛋白酶(ser)、核酸酶(exu)及脂肪酶(lip)6种毒力因子基因。药敏试验结果显示,分离菌J YX-1对克拉霉素、妥布霉素及链霉素等11种药物敏感。本研究结果为鲫鱼感染维氏气单胞菌的鉴定及治疗提供了理论依据。     

A型产气荚膜梭菌重组α毒素对小鼠的致病性研究

为了研究A型产气荚膜梭菌α毒素(PLC)的致病性,采用PCR扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,构建重组质粒pGEX-plc,经IPTG诱导表达获得重组蛋白PLC。对纯化鉴定后的PLC蛋白进行细胞毒性试验,结果显示,感染后第4小时Hela细胞开始出现病变,并随时间延长而逐渐严重,说明α毒素对Hela细胞有毒性作用。进一步建立小鼠病理模型,重组PLC蛋白接种组与阳性细菌感染组的病理变化显示,小鼠发病迅速,腹部膨大,肠道臌气明显;组织学观察结果显示,被感染小鼠内脏器官出现不同程度的病理变化,以小肠各段尤为明显,表现为肠黏膜损伤、绒毛脱落等。上述结果为A型产气荚膜梭菌致病机制的研究奠定了基础。     

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及其毒力的测定

为探究引起保育猪死亡的病原菌的生物学特性、耐药性及毒力,通过形态学观察、生理生化特性测定、16S rDNA基因序列分析、药敏试验、半数致死量测定对分离菌株进行鉴定。结果表明,分离菌株为奇异变形杆菌,16S rDNA基因进化树分析表明该分离菌株与来自印度海水中的分离菌株CIFRI P-TSB-13(JF784025)的亲缘关系最近;分离菌株对头孢西丁、头孢他啶、大观霉素、氨曲南这4种抗生素高度敏感,对米诺环素、呋喃妥因、阿米卡星等10种抗生素中度敏感,对庆大霉素、氧氟沙星、左氟沙星等21种抗生素不敏感,表明分离菌株具有多重耐药性。分离菌株感染斑马鱼的半数致死量为2.12×10~5CFU/mL,感染昆明小鼠的半数致死量为1.46×10~7CFU/mL。证实引起本次保育猪细菌感染的病原为奇异变形杆菌,且该分离菌株的毒力较强,建议治疗时应针对性地选择高敏抗菌药物。     

黑豚鼠源链球菌的分离鉴定

为确定南宁市吴圩镇某黑豚鼠养殖场发生死亡的原因,从发病黑豚鼠眼分泌物、囊肿及肺中分离到可疑细菌,经形态观察、生理生化特性测定及16S rRNA序列分析,鉴定该分离菌为马链球菌兽疫亚种。经小白鼠回归试验证实,该分离菌可致死小白鼠。分离菌16S rRNA与马链球菌兽疫亚种(AB104843)的同源性最高,达99.8%。进化树分析显示,该分离菌与马链球菌兽疫亚种(AB104843)、马链球菌马亚种(JQ726495、JQ726496)的遗传关系最近,处于同一分支上。药敏试验显示,该分离菌对氨苄青霉素、氨曲南、头孢拉定、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢呋辛、链霉素、卡那霉素等高度敏感,对青霉素、亚胺培南、四环素、多西环素等不敏感。结果表明,马链球菌兽疫亚种16-58是南宁市吴圩镇某黑豚鼠养殖场豚鼠致死的病原菌。