非洲马瘟病毒NS1蛋白在昆虫细胞中的表达及抗原性分析

非洲马瘟（African horse sickness,AHS）是一种由媒介昆虫传播感染马属动物的病毒性疾病,为了在杆状病毒表达系统中表达AHSVNS1蛋白并评估其作为亚单位疫苗组分的抗原性,本研究参考GenBank上公布的AHSV基因序列,人工合成NS1全长基因序列,利用PCR方法扩增完整的开放阅读框后将其克隆到转座载体pFastBacTMHTb上,将成功构建的重组质粒pFastBac-AHSVNS1转化到DH10Bac感受态细胞中,获得了含有AHSVNS1基因的重组杆粒Bacmid-AHSVNS1,将其转染到Sf9昆虫细胞内获得了表达AHSVNS1蛋白的重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,表达的重组AHSV NS1蛋白大小为65 ku,且获得了纯化的重组AHSV NS1蛋白。将其免疫BALB/c小鼠,细胞免疫荧光和Western-blot试验显示获得了特异性的抗AHSV NS1蛋白多克隆抗体,其效价达1∶51 200。流式细胞分析显示,AHSV NS1蛋白免疫小鼠能够刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞的增加。上述研究结果表明,AHSV NS1蛋白作为AH...     

马流产沙门菌鞭毛重组蛋白FliC的原核表达及对小鼠的免疫保护试验

为研究马流产沙门菌新疆分离株鞭毛蛋白FliC(flagellin C)的免疫生物学特性及保护特性。本研究利用PCR技术扩增获得该菌的Fli C基因,并将其连接到原核表达载体p ET-28a(+)上,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western-blot检测与分析表达蛋白,并将纯化的重组蛋白免疫小鼠。结果显示,成功诱导表达了52 ku的重组蛋白,该蛋白第2次免疫小鼠第14天时血清中的特异性Ig G抗体效价可达1∶72 900,且抗体亚型以Ig G1为主,免疫小鼠的攻击保护率可达73%。结果表明,Fli C重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。为进一步开展马流产沙门菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

PRRSV中和表位串联Fc分子的表达与免疫原性鉴定

为融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中和表位和Fc分子,首先合成PRRSVGP3和GP5的串联B细胞中和表位与鼠Ig G1-Fc的m Fc-GP35-Bp基因片段,将其克隆到pFastBac载体上,构建重组质粒pFastBac-m Fc-GP35-Bp,经蓝白斑筛选出重组杆粒Bacmid-m Fc-GP35-Bp,并转染昆虫Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBV-m Fc-GP35-Bp。通过Western-blot分析重组蛋白的反应原性,免疫小鼠后,通过间接ELISA检验其免疫原性,病毒中和试验检测中和抗体水平。结果显示,m Fc-GP35-Bp蛋白在昆虫Sf9细胞中获得表达,且可分泌至上清;用m Fc-GP35-Bp蛋白免疫小鼠后,ELISA测定抗体效价可达1∶100 000,三免后第4周仍可检测到较高抗体水平;中和抗体效价介于1∶40和1∶80之间。结果表明,表达的重组m Fc-GP35-Bp蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,可刺激机体产生中和抗体,与Fc分子融合表达延长了抗体在血清中存在的时间,本试验为PRRSV中和表位疫苗的研发奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术,扩增出口蹄疫病毒(FMDV)VP2基因,并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞,获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后,感染sf9细胞,表达VP2融合蛋白,分子质量为33 ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体,通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定,说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达,且可以与牛抗O型FMDV血清发生特异性反应。     

蓝舌病病毒NS3蛋白的截短表达及其多克隆抗体制备

首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病病毒1型(BTV1)NS3基因的截短片段,将其克隆至表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-NS3,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后用IPTG诱导表达,可溶性分析显示,重组NS3蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达。纯化重组表达的NS3蛋白,免疫新西兰白兔制备抗NS3蛋白的多克隆抗体,利用免疫印迹和细胞免疫荧光试验检测该抗体的特异性及NS3蛋白在BTV感染细胞内的分布。结果显示,制备的抗NS3多克隆抗体不仅可与重组表达的NS3蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然NS3/NS3A蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞以及KC细胞中均检测到了NS3/NS3A蛋白的特异性表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组NS3蛋白并制备了相应的特异性抗体,为进一步研究NS3蛋白的特性和功能奠定了基础。     

山羊痘病毒L1R蛋白的原核表达及其免疫原性的研究

为探究山羊痘病毒L1R蛋白的免疫原性,将山羊痘病毒的L1R基因克隆到p ET-30a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后进行纯化,将纯化的重组L1R蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、淋巴细胞增殖和微量中和试验研究重组L1R蛋白的免疫原性及其多克隆抗体的抗病毒作用。结果显示,成功表达出分子质量约为26 ku的目的蛋白,其可被山羊抗绵羊痘阳性血清所特异性识别。重组L1R蛋白能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫,并且其多克隆抗体能够中和山羊痘病毒,从而证实山羊痘病毒L1R蛋白具有良好的免疫原性。     

禽流感病毒M2e多拷贝重组蛋白的原核表达及其免疫原性分析

为了获得流感病毒M2e多拷贝重组蛋白并分析其免疫原性,通过比对GenBank中H5和H9亚型流感病毒的M2基因,选择其N端由23个氨基酸组成的胞外域(M2e)序列进行合成,并将4个M2e序列与3个位于HA246~260T/B细胞表位交叉串联,在其末端添加酵母转录因子,然后克隆到pGEX-6P-1载体中,表达重组蛋白。SDS-PAGE和蛋白免疫印迹试验分析表明,重组蛋白成功表达,而后纯化获得高纯度产物。经纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合后肌肉注射BALB/c小鼠,二免2周后采集小鼠血清并用ELISA检测M2e抗体水平;同时分离脾细胞并用ELISPOT检测特异性T细胞的数量。ELISA结果表明重组蛋白能诱导免疫组小鼠产生高水平的M2e特异性抗体;ELISPOT分析显示,在M2e肽段的刺激下,免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞中的斑点形成数达150个。结果表明,成功表达的重组蛋白具有良好免疫原性,为广谱型流感病毒亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)表面蛋白(surface protein,SU protein)和抗SU蛋白的多克隆抗体,根据Gen Bank已登录的ENTV Shaanxi株SU基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增SU基因并将其连接于原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒p ET-28a-SU,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为43 ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化、复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western-blot分析结果表明,原核表达纯化的SU蛋白能够与制得的小鼠抗SU蛋白多克隆抗体特异性结合。上述结果表明,本试验成功获得了纯化的ENTV SU蛋白和小鼠抗ENTV SU蛋白的多克隆抗体,为进一步研究SU蛋白在ENTV感染过程中的作用和建立诊断方法提供了材料。     

小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。     

基于乙肝核心抗原和猪流行性腹泻病毒S蛋白B细胞复合表位基因重组疫苗的免疫原性研究

为了研制新型、有效的猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗,本研究以乙肝核心抗原蛋白(HBcAg)作为多表位免疫原的载体蛋白,将PEDV S蛋白中的3个B细胞表位基因与S1截短序列基因串联后,插入到编码HBcAg的免疫显性区的基因中,构建重组质粒HBcAg-PE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白HBPE经过纯化和Western-blot鉴定后,以不同剂量的重组蛋白通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,对其免疫效果进行了初步评价。结果显示,重组蛋白HBPE在BL21(DE3)中以沉淀形式表达,纯化、复性后的重组蛋白HBPE能够与PEDV阳性血清发生特异性反应。重组蛋白HBPE能够刺激小鼠产生抗PEDV特异性抗体,同时可以产生相关的Th1型和Th2型细胞因子。上述结果表明,本研究成功构建了PEDV重组B细胞复合表位抗原HBPE,并在小鼠模型中初步评价了其免疫原性,为今后新型PEDV基因工程疫苗的研制提供了新的思路。     

J亚群禽白血病病毒膜表面糖蛋白基因gp85的克隆与表达

以pGEM IMC2 .2 重组质粒为模板扩增禽白血病病毒内蒙株IMC10 2 0 0 gp85基因 ,构建了转移载体pFastBacl IMCgp85 ,并利用Bac to Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac IMCgp85。转染Sf 9细胞后的表达研究表明 ,重组杆状病毒可高效表达IMC10 2 0 0 的gp85基因 ,表达产物具有病毒的抗原特异性 ,与ALV J单抗JE 9有强的间接免疫荧光反应。蛋白质印迹法分析表明 ,表达产物的分子质量约 5 4ku。     

鸡CTLA-4胞外区的原核表达与免疫佐剂作用

为了探索鸡细胞毒性T细胞相关抗原-4(CTLA-4)胞外区(ChIgV)作为免疫佐剂的可行性,采用RT-PCR从鸡外周血淋巴细胞扩增ChIgV编码序列;测序结果显示,其核苷酸序列与已发表序列的同源性为100%。将猪CD151基因片段克隆入原核表达载体pET-30a和ChIgV融合表达载体pET-ChIgV,获得重组表达载体pET-CD151和pET-ChIgV-CD151。分别将pET-CD151和pET-ChIgV-CD151转化BL21(DE3)大肠杆菌,用IPTG诱导重组菌表达,SDS-PAGE结果显示,能表达预期的18ku和28ku重组蛋白,表达产物均为不溶性包涵体。采用包涵体纯化法和尿素变性/复性法获得了纯化的可溶性重组蛋白。以每只500μg剂量2次免疫SPF鸡,用间接ELISA测定血清抗体效价,结果显示,CD151免疫组在初免后第3周特异抗体检测为阳性,第5周抗体效价达到1∶13 000;ChIgV-CD151免疫组在初免后第2周特异抗体检测为阳性,第4周抗体效价达1∶53 000。分别用CD151和ChIgV-CD151免疫血清进行Western-blot检测,结果显示,均能在CD151阳性猪肺巨噬细胞膜蛋白中检测到预期的29ku蛋白条带,而在CD151阴性PK-15细胞膜蛋白中不能检测到相应的蛋白条带。表明,ChIgV可作为鸡抗原提呈细胞的靶向导入分子和新型免疫佐剂。     

非洲猪瘟CD2v胞外区基因片段的真核表达及其多克隆抗体的制备

本研究利用真核表达系统表达非洲猪瘟病毒的CD2v胞外区蛋白,研究其免疫特性,制备多克隆抗体并研究其性质,为研发特异性单抗奠定数据基础。以非洲猪瘟病毒Wuhan2019-1株(GenBank:MN393476.1)为模板,合成CD2v胞外区基因序列,并将其克隆至真核表达载体pCAGGS载体中,获得pCAGGS-CD2v胞外区重组质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染293F细胞,获得重组胞外CD2v蛋白(简称His-CD2v)。用Ni-NTA柱纯化His-CD2v,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用ELISA和间接免疫荧光对多克隆抗体进行鉴定。结果显示,(1)His-CD2v融合蛋白在293F中以可溶形式表达,SDS结果显示,相对分子质量约为35~80 ku的弥散带;(2)融合表达的His-CD2v能与阳性血清反应,与对照不反应;(3)HisCD2v制备的多抗效价最高达1∶218700,且能与阳性血清竞争性结合CD2v抗原。上述结果表明,His-CD2v融合蛋白的表达及其多抗的成功制备,为进一步筛选CD2v特异性单抗及研制竞争ELISA试剂盒,为非洲猪瘟感染与免疫鉴别方法的建立奠定了坚实的基础。     

扬子鳄Mx基因的原核表达和纯化及其多克隆抗体的制备

扬子鳄Mx以蛋白质的形式发挥其抗病毒功能,本试验通过构建pET28a-Mx质粒,将其转化入大肠杆菌感受态细胞中,用IPTG诱导其进行蛋白大量表达,并纯化蛋白。将纯化好的蛋白作为抗原,与弗氏佐剂充分乳化,免疫6周龄的BALB/c雌性小鼠,4次免疫后提取其血清,测定效价。应用Western-blot检测制备的鼠抗扬子鳄Mx多克隆抗体的特异性。结果显示,扬子鳄Mx蛋白原核表达载体构建成功,并且应用切胶纯化的方式成功纯化了该蛋白。制备的鼠抗扬子鳄Mx多克隆抗体的效价达1∶51 200以上。本试验研究结果为进一步研究扬子鳄Mx蛋白的抗病毒功能提供了物质条件。     

西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σB基因在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

本研究旨在通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物学活性的禽呼肠孤病毒σB蛋白。首先,根据NCBI中ARVσB基因序列,设计引物构建σB基因重组供体质粒pFast-σB。随后转化DH10bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-σB。通过脂质体介导法转化sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-σB。将重组病毒感染sf9细胞,表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光(IFA)检测表明,ARVσB蛋白在sf9细胞中成功表达,分子量约为41 ku,并具有良好的生物学活性,为进一步研究ARVσB基因的功能及其基因工程亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因,将扩增产物与pGEM-T easy载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting;用所表达的蛋白免疫小鼠,经ELISA检测血清抗体,验证其免疫原性。结果显示。所克隆的T24基因片段长716 bp。含有1个678 bp的开放阅读框,其编码226个氨基酸,与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％;表达的融合蛋白大小为40 ku,并能被猪囊虫阳性血清识别;免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体,第30 d达到较高水平,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。     

鸭肝炎病毒VP1和VP3基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

为了构建鸭肝炎病毒VP1和VP3结构蛋白基因的杆状病毒表达载体,以RT-PCR方法扩增鸭肝炎病毒的VP1和VP3基因,克隆至pGEM-T载体。经筛选测序验证后,以BamHⅠ+XhoⅠ双酶切回收VP1和VP3目的片段,与经相同方法处理的杆状病毒转座载体pFastBac1连接,得到重组质粒pFastBac1-VP1和pFastBac1-VP3。将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选,成功获得各自携带VP1和VP3基因的重组穿梭载体,将其命名为rBacmid-VP1、rBacmid-VP3。研究结果为进一步在昆虫细胞中表达VP1或VP3基因,开发研制鸭肝炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究

为研究羊口疮病毒(ORFV)新型亚单位疫苗,设计了ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白,命名为HBBH并经原核表达和鉴定。以不同剂量HBBH不加或加不同佐剂,经滴鼻或颈部皮下注射免疫BALB/c小鼠,其中滴鼻共4组(HBBH 10μg、20μg、30μg和20μg+LTB),注射组(HBBH 20μg+201佐剂)。同时设ORFV组织灭活抗原+201佐剂注射免疫对照和空白对照,每组共免疫3次,每次间隔7 d。HBBH间接ELISA检测一免、二免、三免后7 d以及三免后14 d血清中ORFV IgG、IgA和三免后14 d肺灌洗液sIgA的抗体水平,取不同水平的IgG ELISA阳性血清检测细胞中和抗体效价。结果显示,表达并鉴定了具有良好反应原性的包含ORFV B2L蛋白优势抗原表位的截短重组蛋白HBBH。免疫小鼠试验结果表明,不同剂量HBBH通过滴鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生ORFV特异性IgG抗体,20μg HBBH+201佐剂注射免疫能最大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。实验小鼠三免后14 d肺灌洗液特异性sIgA仅在HBBH滴鼻免疫剂量≥20μg的三个组中检测到,其中30μg HBBH组刺激小鼠产生了最高水平的sIgA。在同为20μg HBBH滴鼻免疫时,添加LTB佐剂刺激小鼠产生了更高水平的sIgA。表明一定剂量的HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫可更好地刺激小鼠产生sIgA。HBBH间接ELISAIgG阳性血清的细胞中和抗体效价可高达1:128,且能中和4株ORFV分离株。结果表明,20μgHBBH+201佐剂注射免疫3次和20μg HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫3次均能刺激BALB/c小鼠产生高水平的抗ORFV血清中和抗体IgG和黏膜抗体sIgA。本研究为ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。     

大熊猫IgG Fc HRP酶标二抗的制备

为获得辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗大熊猫Ig G抗体,本研究利用重组大肠杆菌表达技术对大熊猫Ig G Fc片段进行了表达,获得重组蛋白后进行了小鼠免疫,抗体特异性检测,并进行了多克隆抗体的HRP标记。结果显示,在37℃、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导5 h的条件下,可获得分子质量约为88 ku的目的蛋白;将重组蛋白免疫小鼠后,免疫小鼠血清与重组蛋白反应效价可达1∶102400以上,且与大熊猫血清Ig G反应良好,经HRP标记试剂盒标记的鼠抗大熊猫Ig G效价可达1∶25600以上。上述结果表明,本研究成功制备了HRP标记的小鼠抗大熊猫Ig G二抗,为大熊猫疾病血清学检测方法的开发提供了支撑。