PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。     

猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞生物学活性的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康仔猪,在接种后不同时间宰杀,收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测PAM凋亡现象,通过EA花环试验测定Fc受体数目,通过吞噬鸡红细胞试验测定吞噬功能,分析PCV2感染对PAM生物学活性的影响。结果显示,在整个试验期内2种方法均没有检测到PAM凋亡,表明PCV2感染不会诱发PAM凋亡。PAM的Fc受体数和吞噬鸡红细胞数的变化规律一致,与对照组相比,两者数量在接种后第3 d明显下降,第7 d有所回升,之后基本恢复,表明PCV2感染后PAM吞噬和清除病原的功能出现短暂下降。     

不同基因簇PCV2b安徽株对感染小鼠免疫应答的影响

为探讨同一基因亚型不同基因簇的猪圆环病毒2型安徽株[PCV2-DY0801(PCV2b-1A)、PCV2-BH0801(PCV2b-1B)、PCV2-XC0801(PCV2b-1C)]对感染小鼠免疫应答的影响,将16只SPF级昆明小鼠随机分为4组,分别接种PCV2-DY0801、PCV2-BH0801、PCV2-XC0801以及PBS,初次感染后第7、14、21和28天采集血液,进行IgG水平、T细胞亚群含量及Th1型和Th2型细胞因子水平的动态检测。结果显示,3株PCV2安徽株感染小鼠后均产生较高水平的IgG,被感染小鼠的外周血中CD4+、CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞的含量显著减少(P0.05),血清中IL-2、IL-4和IL-10的质量浓度显著升高(P0.05),其中BH0801组在初次感染后第14天CD4+含量显著低于XC0801组(P0.05),第21天IgG水平显著高于XC0801组(P0.05),第14、21天IL-2的质量浓度显著高于XC0801组、DY0801组(P0.05)。PCV2-BH0801诱导体液免疫反应最强,PCV2-XC0801诱导细胞免疫反应最强,而PCV2-DY0801均居中。结果表明,同一基因亚型不同基因簇的PCV2安徽株对感染小鼠的免疫应答有影响。     

两株PRRSV NSP2不同位置缺失基因工程病毒的生物学特性分析

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2高变区对病毒复制及相关细胞因子表达水平的影响,以PRRSV GSWW/2015强毒株感染性分子克隆为基础,在前期缺失NSP2第519～565位47个氨基酸的D5毒株的基础上,进一步缺失了NSP2第628～747位120个氨基酸(D14),并比较分析了缺失毒株与亲本病毒GSWW的复制能力。结果显示,D14缺失病毒相对于D5缺失毒与亲本病毒GSWW/2015的复制水平有所降低,但三者之间无显著差异。将亲本病毒、D5与D14缺失毒株分别感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),于不同时间点检测了炎性细胞因子m RNA的表达水平。结果表明,在感染PAM后第24小时,相对于D14缺失病毒与亲本毒,D5缺失毒诱导IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1βm RNA表达水平显著上升;D5与D14缺失毒在感染PAM细胞后第12小时,诱导IL-10、HMGB1水平显著降低,D14的降低幅度更显著。提示D5缺失区有促进早期炎性应答的作用,D5与D14缺失均可以明显降低IL-10抑制性细胞因子的表达水平。说明NSP2在调节炎性应答与免疫抑制方面具有重要的作用。     

禽呼肠孤病毒感染鸡胚成纤维细胞后三种细胞因子基因mRNA转录水平的动态变化

为了分析禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)对细胞产生的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影响,并探讨禽呼肠孤病毒的感染机制及病毒与宿主之间的作用关系,运用实时荧光定量RT-PCR技术,测定和分析了ARV-S1133感染CEF细胞后ARV结构蛋白σC和IL-1β、IL-6、TNF-α的动态转录水平。结果显示,ARV-S1133感染CEF后第10小时起病毒σC基因mRNA的相对表达量开始迅速上升,在第48小时达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量发生变化,这3个基因mRNA的表达变化趋势相似。IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA转录水平在感染早期迅速上升,在感染后第6小时达到第1个峰值,随后下降,在感染中后期再次显著上升,在第48小时达到第2个峰值。IL-1β、IL-6、TNF-α在感染后第6、24、36和48小时的mRNA转录水平与对照组差异极显著(P0.01)。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-1β、IL-6、TNF-α的水平上调,进而发生炎症反应,说明IL-1β、IL-6、TNF-α可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。     

刺五加多糖对鸡血液免疫相关细胞因子mRNA表达水平的影响

本研究通过实时荧光定量PCR方法,观察皮下注射刺五加多糖(ASPS)对雏鸡血液免疫相关细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-αmRNA表达水平的影响,从而通过分子水平对ASPS的免疫增强作用进行评价。1日龄海兰褐公雏饲养至7日龄时选取150只,随机分为3组,每组50只。第1组和第2组为ASPS低剂量组和高剂量组,分别用ASPSL和ASPSH表示,两组分别皮下注射100 mg/mL和200 mg/mL的ASPS;第3组为空白对照组,注射等量灭菌生理盐水。所有组每天注射1次,ASPS和生理盐水均为0.2 mL,连续注射3 d。免疫后的第7、14、21、28天分别取血液分离淋巴细胞,提取淋巴细胞中的总RNA,反转录成cDNA,以进行荧光定量PCR检测。结果显示,在ASPS作用下,Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-2)和Th2类细胞因子(IL-4、IL-10) mRNA的表达量呈现不同的变化趋势,IFN-γ和IL-2较早开始增多,并在免疫后第21天时达到峰值后下降,而IL-4和IL-10变化较晚,但是持续增多,并在免疫后第28天达到峰值。同时,ASPS能够不同程度地增加IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-αmRNA表达量,尤其是IL-6,相比于其他细胞因子,IL-6的mRNA相对表达量变化幅度最大,免疫后第21、28天各组表达水平接近,ASPSH组的相对表达量最高,达到5左右。结果表明,ASPS能够不同程度地促进IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α等8种细胞因子的mRNA表达,但是表达的变化幅度、变化趋势以及变化时间均有不同。     

伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型混合人工感染仔猪排毒的检测

为了解伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)感染仔猪后不同时间点的病毒载量及排毒规律,将34头健康仔猪分为4组,第1~3组分别为人工接种PRV、PCV2和PRV+PCV2组,第4组为空白对照组。分别在接种后第3、7、14、21、35天采集试验仔猪的鼻拭子和肛门拭子,用Taq Man荧光定量PCR(q PCR)对其进行定量检测,并分析仔猪排毒的变化规律。结果,接种后第3天,3个试验组仔猪肛门拭子、鼻拭子中均分离到PRV或PCV2;其中PRV单独感染后的病毒载量在第14天达到峰值331.67 copies/L;PCV2单独感染后的病毒载量在第3天达到峰值10 742.01 copies/L;PRV+PCV2混合感染后鼻拭子和肛门拭子的PRV分别在第14天和第7天达峰值980.96 copies/L和2 230.056 copies/L;鼻拭子和肛门拭子PCV2在感染后第14天达到峰值69.413 copies/L和271.72 copies/L;混合感染仔猪于感染后第8~14天发生死亡。3个感染组之间无论是肛门拭子还是鼻拭子,PRV、PCV2病毒载量均差异显著(P0.05)。上述结果表明,PRV单独感染、PCV2单独感染和二者混合感染均对仔猪造成严重危害,除引起仔猪发病死亡外,这2种病毒均能通过呼吸道和消化道向外排毒。     

猪圆环病毒2型感染昆明小鼠模型的建立

将SPF级昆明小鼠随机分为3组,即一次攻毒组(S组)12只、连续攻毒组(M组)3只和对照组(C组)12只.S组和C组小鼠于第1d分别接种RPMI1640培养液和猪圆环病毒2型(PCV2)细胞培养毒,M组小鼠于第1、7、14、28、35d连续进行PCV2接种.S组和C组小鼠分别在接种后第7、14、28和42d各处死3只,M组小鼠在接种后第42d全部处死,分析其增重、病毒组织分布、抗体水平、病理组织学变化.结果,C组小鼠体重增长速率大于S组和M组,S组又明显高于M组;S组和M组小鼠体内存在病毒复制,而C组小鼠体内无病毒复制;S组和M组小鼠均产生PCV2抗体,但M组小鼠抗体水平明显高于S组,C组小鼠未检测到PCV2抗体;S组和M组小鼠有明显的病理损伤,其中淋巴结损伤最严重,C组未发现病理损伤.结果表明PCV2可以成功感染SPF昆明小鼠.     

Prohibitin 2基因参与猪圆环病毒2型PK-15细胞感染的研究

为探究Prohibitin2(PHB2)在PCV2感染细胞过程中发挥的作用,首先通过间接免疫荧光试验检测PCV2在PK-15细胞中的增殖变化,同时建立PHB2荧光定量PCR检测体系,然后以PCV2已知的宿主细胞互作蛋白gC1qR为对照,检测PCV2感染PK-15细胞后PHB2 mRNA的动态变化,最后鉴定PHB2 siRNA转染PK-15细胞中PCV2 Cap的表达。结果表明,PHB2在正常及PCV2感染的PK-15细胞中均有效表达。随着PCV2感染PK-15细胞,gC1qR转录水平在病毒感染3 h显著降低,感染6 h时升高,随后(12~48 hpi)转录水平下降;而PHB2转录水平在PCV2感染6 h内显著升高,随后(12~48 hpi)mRNA水平有所下降;RNA干扰PHB2对PCV2在PK-15细胞中复制起到显著的抑制作用。上述研究结果表明,PCV2可显著影响PK-15细胞中PHB2转录,而且PHB2对PCV2病毒复制具有调节作用。     

猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染的6周龄仔猪,于感染前和感染后第3、7和10 d,采用血常规法、SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术分析了感染猪外周血中白细胞、粒细胞、单核细胞、NK细胞、γδT细胞的含量。结果,感染后第3 d和第7 d,PRRSV感染组、PCV2感染组以及PRRSV+PCV2共感染组猪的白细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、γδT细胞总数显著下降,并且共感染组比单感染组下降更加严重。结果表明,PRRSV+PCV2共感染对仔猪外周血天然免疫细胞的影响具有协同效应,意味着在感染早期可导致更加严重的先天免疫抑制。     

重组猪源CD40L体外诱导猪肺泡巨噬细胞IL-1β和TNF-α的分泌

本试验旨在研究重组猪源CD40L蛋白(recombinant porcine CD40L,rpCD40L)的生物学活性。利用Alexa Fluor 488标记rpCD40L后,在体外与CD40+原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)作用,荧光显微镜观察rpCD40L与PAMs的结合,并通过qPCR、ELISA检测作用12 h和24 h后PAMs IL-1β和TNF-αm RNA与蛋白水平的变化。结果显示,荧光标记的rpCD40L与CD40+PAMs作用后,PAMs呈现绿色荧光,rpCD40L与PAMs作用后在基因和蛋白水平促进了IL-1β和TNF-α的表达。结果表明,课题组前期获得的rpCD40L能够与CD40+PAMs结合,且诱导PAMs IL-1β和TNF-α的分泌。     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了西宁市8个规模养殖场和部分散养户的161份猪血清样品的猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果显示,所有被检猪场均有PCV2抗体阳性猪存在,161份血清样品中PCV2抗体阳性率为86.95%。从上述样品中随机抽取28份样品,用PCR方法检测了PCV2 ORF1基因;结果,从13份血清中扩增到了特异性PCV2 ORF1基因,阳性率为46.42%。证实,西宁市猪场和散养猪群中存在PCV2感染。     

肺泡巨噬细胞在猪链球菌2型引致肺炎过程中的作用

为探明肺巨噬细胞在猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)引致肺炎过程中发挥的作用,用SS2体外感染4周龄SPF巴马小型猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),首先以10倍递增的SS2∶PAM感染比(MOI)分别为1∶10～1 000∶1感染12h;其次以MOI=100∶1分别感染1、2、4、6、12、24h,ELISA检测三种主要炎性细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的质量浓度及动态变化,同时光镜观察PAM的形态变化。结果显示,三种细胞因子具有相似的动态表达趋势,其表达量均随MOI升高和作用时间的延长而上升,与对照组之间均差异极显著(P<0.01),菌液浓度之间和时间点之间均差异显著(P<0.05);同时PAM的形态异常和崩解死亡比例依次增多,表明三种炎性因子的表达量与SS2的浓度和感染时间之间呈正相关;受损或濒死细胞比例亦正相关;提示三种炎性因子由受损细胞或濒死细胞产生。MOI为1∶1感染12h,或MOI为100∶1感染6h的条件下均可致70%的PAM崩解死亡,表明此条件下SS2可摧毁由PAM构筑的第一道防线。三种炎性细胞因子表达最高峰的条件是MOI为100∶1,感染12h,此时镜下细胞几乎全部崩解死亡,表明PAM的完全死亡伴随炎性因子的最大释放,炎症随吞噬功能的完全丧失而开始。结果表明,在SS2引致肺炎过程中,AM的作用是炎症的起始者,而不是抵御细胞。     

猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法.用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应.该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验.用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%.另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%.表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重.     

杭州地区猪Ⅱ型圆环病毒抗体的血清学调查

从浙江省杭州地区 2 8个猪场采集猪血清 1 6 77份 ,用间接荧光免疫试验进行了猪Ⅱ型圆环病毒 (PCV 2 )抗体检测。共检出抗体阳性血清 96 0份 ,总阳性率为 5 7.2 5 % ,其中经产母猪的阳性率为 6 2 .32 % ,后备母猪的阳性率为 5 5 .5 5 % ,断奶后仔猪的阳性率为 5 5 .4 8% ,断奶前仔猪的阳性率为 5 2 .98%。血清学调查结果显示 ,PCV 2在杭州地区猪场的感染较普遍     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

云南省红河州猪繁殖障碍综合征的流行病学调查

针对云南省红河州猪繁殖障碍综合征严重危害养猪业的情况,对全州12个县(市)21个种猪场982户农户的4 329头繁殖母猪和种公猪进行了流行病学调查。结果表明,猪繁殖障碍综合征发病率在种公猪为23．6％,妊娠母猪为40．6％．初生仔猪死亡率为18．6％;在死亡仔猪中,流产占10．1％,死胎占54．5％,弱仔占32．5％,畸形占2．9％。初步查清了引起红河州猪繁殖障碍综合征的主要病原有细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、衣原体(Chlamydia)、乙型脑炎病毒 (JEV)、刚地弓形虫(TG)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、圆环病毒2型(PCV2)、布鲁氏菌 (Bruc)和猪瘟病毒(CSFV)等9种,其中CSFV的带毒率为1．1％,其他病原的血清抗体阳性率分别为PPV 27．7％,PRV 24．6％,衣原体22．8％,JEV 13．6％,TG 12．0％,PRRSV 11．5％,PCV2 7．2％,Bruc 4．6％,总阳性率达75．4％,其中单一病原抗体阳性率为39．6％,两种和两种以上病原抗体阳性率为35．6％。