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相似文献
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1.
根据A型H1N1亚型流感病毒2009年北美变异株和H3N2亚型流行株的基因序列,设计了3套特异性引物、TaqMan探针,分别用不同的荧光基团标记,以构建的A型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组质粒作为阳性对照,经反应条件优化,特异性、敏感性和重复性试验,筛选出3套不同的反应体系及同一个反应参数,建立了可同时检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法。结果表明,该方法可特异地检测H1N1(人源、猪源)、H3N2(猪源),禽流感病毒H5、H9等A型流感病毒,且与新城疫病毒、减蛋综合征病毒等其他病毒不发生交叉反应,具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点,试验耗时仅3h。表明,建立的方法,一次试验即可完成A型流感病毒的初筛和H1N1、H3N2亚型流感病毒的初步确认定型。  相似文献   

2.
2017年初在中国出现的H7N9流感病毒变异株表现出对禽高致病性的特征,根据高致病性H7N9流感病毒(HP-H7N9)的HA基因序列,设计1组HP-H7N9特异性的引物和探针,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性、敏感性和重复性试验,制作了标准曲线。结果显示,本方法只对HP-H7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到35.45 copies的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法的建立将为HP-H7N9的诊断、监测和防控提供快速、特异、敏感的技术手段。  相似文献   

3.
H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立   总被引:3,自引:0,他引:3  
根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV.使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-N2NA标准品绘制标准曲线,其相关系数分别为0.990 15(H3HA)和0.999 47(N2NA).检测结果显示,该方法的敏感性可达100 copies/μL,除H3N2亚型SIV外,对H1亚型、H9亚型SIV以及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒和猪2型圆环病毒的检测均为阴性,应用该方法对实验室感染样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为95.83%.表明,该方法特异性强、重复性好,有望成为H3N2亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法.  相似文献   

4.
应用PCR技术结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立通用型猪流感病毒的快速筛检方法。查找、分析猪流感病毒M基因的保守区,设计了1对特异性引物。RT-PCR扩增后经变性高效液相色谱技术分析研究方法的特异性、敏感性和应用性。DHPLC法能特异性检出H1N1、H5N1和H3N2亚型猪流感病毒,与猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型无交叉反应。对构建的含有M基因的重组质粒,该方法的检出下限为100copies核酸。对210份存档猪流感鼻拭子样品,DHPLC法与商业化定量PCR的检测结果完全一致。DHPLC技术为临床大批量猪流感样品的监测提供了一种新的、自动化、高通量的核酸分析平台。  相似文献   

5.
为探索新近暴发的甲型H1N1流感病毒各基因片段的变异性与本次疫病流行的内在原因,以NCBI GenBank中报道的l株新发的典型H1N1甲型流感病毒A/New York/1669/2009(H1N1)作为研究对象,运用在线BLAST和CLUSTAL X等生物信息学软件对其PA、NP、M、PB1、PB2、NA、HA和NS基因片段进行了比较分析.结果表明,新发甲型H1N1流感毒株的PB1、NP基因来源于人源谱系流感病毒,HA、NA、NS、M基因来源于猪源谱系流感病毒,PB2和PA基因来源于禽源谱系流感病毒.此外,新发甲型H1N1流感病毒的HA和NA分别在第249和386位新出现1个"-NTT-"、"-NFSI-"的糖基化位点.HA的6个潜在抗原决定簇中有3个发生了氨基酸序列改变,NA则是12个中有5个发生了改变.表明,这些抗原基因的大范围重组与高频率变异可能是造成这次流感暴发与大规模流行的根本原因.  相似文献   

6.
H1N1亚型猪流感病毒HA基因的表达及单克隆抗体的制备   总被引:4,自引:0,他引:4  
采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA基因进行了生物信息学分析。将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。诱导表达的HA融合蛋白分子质量约为94.0 ku,表达产物占菌体总蛋白的29.5%。经Western-blot分析证实可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,成功筛选到2株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体;ELISA结果表明,制备的SIV单克隆抗体ⅢF6A4C10与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性,为H1N1 SIV的鉴别诊断奠定了基础。  相似文献   

7.
为探究欧洲禽源N A和M基因对重组猪流感病毒致病性的影响,通过对猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07(H 1N2)(S12)与A/swine/Zhejiang/1/07(H1N1)(Z11)进行测序以及基因型分析,确定了2009甲型H1N1流感病毒的PB 2、PB1、PA、HA、NP和NS基因均起源于三源重组H1N2亚型SIV(S12),NA和M基因均起源于欧洲禽源H1N1亚型SIV(Z11)。利用RT-PCR技术对Z11的NA和M基因分别进行扩增及克隆,以S12为骨架,成功拯救到含有欧洲禽源NA、M基因的重组病毒。通过检测不同病毒在MD CK、A549、PK15细胞上的生长特性,并以小鼠为模型对不同病毒的致病性进行了差异性分析。研究结果表明,欧洲禽源H1N1亚型SIV的NA和M基因相互协同地提高了病毒在体外多种细胞以及小鼠肺内的复制能力,增强了病毒对小鼠的致病性,这为甲型H1N1流感病毒的分子致病机制研究提供了理论依据,对猪流感的防控及预警具有重要意义。  相似文献   

8.
有效防治猪流感需要借助于准确而快速的检测方法,为了建立一种高效、快速的多重检测方法,本研究应用H1和H3亚型猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白抗原偶联不同编码的荧光微球,应用间接法检测模式,建立了H1、H3亚型猪流感病毒IgG抗体荧光微球免疫学检测方法,并将该方法与血凝抑制试验(HI)、病毒中和试验(VN)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行比较分析。结果表明,该方法的抗体检测灵敏度比ELISA方法高100~1 000倍;与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒及日本乙型脑炎病毒的阳性血清均无交叉反应,且两种亚型血清之间也不存在交叉反应。重复性试验表明,批内和批间精密度测试结果分别为10.2%和12.8%。与HI、VN和ELISA方法比较,总符合率分别为97.82%、98.27%和97.83%。综上,本研究建立的检测方法具有双重检测特性,特异性好、灵敏性高、重复性强,可用于H1、H3亚型SIV的鉴别诊断。  相似文献   

9.
根据H 7N 9亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因保守区域,分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了基于高分辨率熔解曲线(HRM)分析的H7N9亚型AIV检测方法。结果显示,该方法特异性强,其他常见禽源病毒及非H7亚型和非N9亚型的AIV不能形成特异熔解峰形;灵敏度高,对H7和N9阳性质粒的最低检测限分别达到1.0×101 copies/L和1.0×100 copies/L;重复性好,熔解峰Tm 1和Tm2的批内和批间变异系数均1%;临床样本检测与某商品化H7N9亚型AIV定量PCR检测试剂盒比较,符合率为100%。该方法可用于临床疑似病例的应急检测、早期诊断及养鸡场、活禽交易市场等外环境H7N9亚型AIV的监测。  相似文献   

10.
从有肺炎症状的病猪中分离到1株H9N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Shndong/1/02,对其进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因片段的核苷酸序列均来自禽流感病毒(AIV),与我国目前家禽中流行的H9N2亚型AIV毒株具有很高的同源性,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)的同源性为94.1%~98.9%,与A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)的同源性为94.5%~98.2%;推导的其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为P-A-R-S-S-R,完全符合H9亚型AIV欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;基因分析结果表明,该分离株的所有基因片段均来源于H9N2亚型AIV,它可直接感染猪,并导致发病,但它并未在猪体内发生重组.  相似文献   

11.
采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体,研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析,并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。  相似文献   

12.
根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-H3,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-H3,将其感染sf9昆虫细胞,收获目的蛋白。经血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot、免疫组织化学分析,结果表明,HA蛋白得到表达,且具有良好的免疫学活性。用表达的HA蛋白作为包被抗原,初步建立了H3亚型猪流感病毒的间接ELISA检测方法,通过对93份送检的疑似猪流感血清进行检测,结果显示,检出阳性率为46.24%。上述结果为建立快速、准确、简便的H3亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。  相似文献   

13.
根据已获得的猪流感病毒(SIV)分离株A/Swine/Guangdong/9/05(H3N2)NP基因的核苷酸序列设计合成了1对带有特定酶切位点的引物,经RT-PCR扩增NP基因,将其克隆到pMD19-Simple-T载体,鉴定并测序正确后,构建pET32a-NP表达质粒,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为73ku,在25℃条件下主要以可溶性形式存在。将重组NP蛋白纯化后进行Western-blotting和间接免疫荧光试验,结果显示,表达蛋白可分别与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有良好的反应原性和交叉反应性;用纯化的重组NP蛋白免疫小鼠制备的多克隆血清也可与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV发生特异性反应,进一步证实所表达的重组NP蛋白具有良好的免疫原性。  相似文献   

14.
H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。  相似文献   

15.
采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%~98.7%,氨基酸同源率为82.6%~97.8%。与其他毒株比较A Goose HLJ P46 2003(H5N1)和A Goose HLJ G2 2003(H5N1)株NS基因在第264~278位处发生了15个核苷酸缺失;A Goose Jilin W2 2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T C突变,成为终止密码子,造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在;H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。  相似文献   

16.
研究建立了禽流感病毒(AIV)A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及H5/N1、H9/N2、A/H5/N1多重RT-PCR检测技术,用于检测或同时检测和鉴别A型及H5N1、H9N2亚型AIV。所建立的RT-PCR和多重RT-PCR从核酸提取、基因扩增到产物分析在3~4h内即可完成,经对36株AIV及相关病毒分离物检测,与病毒分离鉴定的结果完全一致,且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用多重RT-PCR检测80份棉拭子样品,并与病毒分离鉴定方法比较,二者H5N1、H9N2亚型的鉴定结果完全吻合。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为临诊样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。  相似文献   

17.
猪伪狂犬病病毒环介导等温扩增检测方法的建立   总被引:2,自引:0,他引:2  
针对猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计并合成了4条引物,建立了伪狂犬病病毒的环介导等温扩增检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性地检测猪伪狂犬病病毒强毒株,不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株;该方法的最低检测量可达100个拷贝质粒DNA,比常规PCR方法的敏感性高10倍。试验表明建立的环介导等温扩增方法具有较高的特异性、敏感性和可重复性,可用于伪狂犬病病毒的快速诊断。  相似文献   

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