牛无浆体PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、特异、敏感的牛无浆体(Anaplasma bovis)PCR检测方法及了解新疆部分地区牛无浆体感染情况,根据牛无浆体16S rRNA基因序列(MH255941.1)设计1对引物,建立了检测牛无浆体PCR方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验、临床样品检测及系统进化分析。结果显示,所建立的方法能特异性地鉴别牛无浆体,与环形泰勒虫(Theileria annulata)、绵羊无浆体(A. ovis)、牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B. bigemina)基因组均无交叉反应,该方法检测下限可达到1.02×10~(-18)g/μL,比文献报道的PCR敏感10倍(8.9×10~(-18)g/μL);具有良好的重复性;对94份牛临床血液样品检测结果表明,牛无浆体的阳性率为54.3%(51/94),高于文献报道的PCR方法的检测结果 37.2%(35/94);系统进化树显示,三个地区的牛无浆体菌株都不在同一分支上。结论,成功构建了牛无浆体PCR快速检测方法,这为牛无浆体的快速诊断及流行病学调查奠定基础。     

贵阳动物园动物隐孢子虫的调查与虫种鉴定

为了解贵阳动物园圈养野生动物隐孢子虫的感染流行情况,以骆驼、黑熊、斑马、袋鼠、猕猴、长臂猿、大象等野生动物的新鲜粪便为样品(n=84),采用饱和蔗糖溶液漂浮法收集隐孢子虫的卵囊并提取D N A,以18S r R NA为目标基因靶点设计特异性引物,并采用巢式PCR扩增目的基因,后经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,对检测结果为阳性的PCR产物进行序列分析并建立系统发育树。结果表明,共有13份隐孢子虫阳性样品,其中骆驼7份,感染率为70.00%,感染虫种为安氏隐孢子虫;斑马1份,感染率为10.00%,感染虫种为安氏隐孢子虫;长臂猿5份,感染率为23.81%,感染虫种为微小隐孢子虫、人隐孢子虫及小鼠隐孢子虫。本次调查发现该园野生动物隐孢子虫具有较高的总体感染率(15.50%)和鉴定出4种人兽共患隐孢子虫虫种,具有较重要的公共卫生意义。本研究首次报道了我国斑马感染隐孢子虫。     

PCR技术在鸟类性别鉴定上的应用

根据鸟类性染色体连锁基因EE0．6在Z、W染色体上长度的不同,通过选择6对不同的引物,同时设置4种不同的反应条件,分别采用PCR技术对丹顶鹤、黑鹳、琉璃金刚鹦鹉、绯红金刚鹦鹉、鞭苔(?)鵼、戴冕鹤、火烈鸟的Z、W染色体上的EE0．6基因进行了特异性扩增。结果显示,某些引物组合能从雄鸟样品中扩增出1条片段(EE0．6Z,190 bp),而雌性鸟样品则能扩增出2务片段(EE0．6W和EE0．6Z,分别为250 bp和190 bp),但4组引物对6种鸟类EE0．6基N的扩增效果不同。证实,利用PCR技术能对鸟类进行性别鉴定。     

马泰勒虫不同PCR检测方法的比较

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫PCR检测方法,用Bec-UF2、Equi-R;EMA-1F、EMA-1R两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的核蛋白体基因和表面蛋白基因进行了常规PCR方法检测,用EMA-5、EMA-6;EMA-7、EMA-8两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的表面蛋白基因进行了PCR和套式PCR方法检测。结果显示,以Bec-UF2、Equi-R为引物的PCR方法的阳性检出率为57.1%(32/56),以EMA-5、EMA-6;EMA-7、EMA-8为引物的套式PCR方法的阳性检出率为51.8%(29/56),以EMA-1F、EMA-1R为引物的PCR方法的阳性检出率为17.9%(10/56)。结果表明,以Bec-UF2、Equi-R为引物的常规PCR方法为检测马泰勒虫的最佳方法。     

可视化多重荧光LAMP鉴别诊断牛轮状病毒和产肠毒素性大肠杆菌的研究

本研究旨在建立一种同时检测牛轮状病毒(BRV)和产肠毒大肠杆菌(ETEC)的多重荧光LAMP检测方法。根据GenBank中BRV和ETEC的基因保守区域设计3套LAMP引物,在每条内引物FIP的5’端标记荧光基团,在同一体系中进行多重LAMP扩增,对各反应条件进行优化,应用该方法对采集自广西各地牛场的56份样品进行检测。结果显示,该方法能特异地鉴别牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌,并与其他对照病原不发生交叉反应;每个反应的检测灵敏度均为100拷贝。对56份腹泻样品的检测结果显示,BRV的感染率为14.3%,ETEC的感染率为57.1%,2种病原的混合感染率为8.9%;与荧光PCR和常规PCR检测方法相比,此多重LAMP方法敏感性为100%,符合率为100%。建立的方法可快速、准确地检测2种犊牛腹泻病原体,为病原学诊断和分子流行病学调查提供了有效技术支持。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

甘肃省部分地区藏羊肠道寄生虫感染情况调查

为了解甘肃省部分地区藏羊肠道寄生虫的感染情况,共采集甘肃玛曲县和碌曲县2个地区177份新鲜粪便样本,采用离心沉淀法、卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖溶液漂浮法对样品进行显微镜检测,然后对隐孢子虫、十二指肠贾第虫和毕氏肠微孢子虫进行PCR检测。结果显示:共检测出8种寄生虫,总感染率为94.35%(167/177)。阿米巴原虫和艾美耳球虫为优势虫种,感染率分别为35.59%(63/177)和84.75%(150/177),其他肠道寄生虫如:毛尾线虫(鞭虫)、圆线虫和贝氏莫尼茨绦虫的感染率分别为6.78%(12/177)、22.60%(40/177)和4.52%(8/177)。显微镜检测结果显示:隐孢子虫和十二指肠贾第虫的感染率分别为1.69%(3/177)和0.56%(1/177),然而PCR检测结果显示隐孢子虫、十二指肠贾第虫和毕氏肠微孢子虫的感染率分别为4.52%(8/177)、1.69%(3/177)和34.46%(61/177)。此外,混合感染现象较为严重,存在2~7种寄生虫感染情况,且玛曲县和碌曲县均以2种寄生虫混合感染最为普遍,总感染率达到38.42%(68/177),高于其他混合感染情况。本次调查研究表明,甘肃地区藏羊肠道寄生虫感染情况普遍存在,藏羊的肠道寄生虫防控和饲养管理方面有待进一步加强。     

信阳土鸡禽白血病的分子生物学与形态学诊断

为全面了解信阳地区土鸡种群中禽白血病的分子流行病学特点,笔者对信阳地区部分规模化鸡场的土鸡(肉蛋兼用型)进行A、B亚群和J亚群禽白血病病毒(ALV)抗体检测和p27抗原检测。并用外源性ALV-A、B、J亚群的特异性序列作为引物,对部分p27阳性病例肝样品进行了PCR检测,同时进行病理组织学分析。结果显示,在调查的92份样品中,ALV-A/B抗体阳性率为5%;ALV-J抗体阳性率为36%;禽白血病p27抗原阳性率为74%。提取10份p27抗原阳性病鸡肝的总RN A,并进行PCR检测,发现ALV-A、B亚群阳性各有1例、J亚群有2例;病理组织学检查发现在肝、肾等部位可见淋巴细胞样肿瘤病灶和髓细胞瘤样病灶。本研究结果提示信阳地区土鸡群中存在着不同亚群禽白血病病毒的感染病例。     

广东部分地区乳牛肠道寄生虫感染情况的调查

为了解广东省奶牛肠道寄生虫感染情况,采用离心沉淀法、卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖漂浮法对广东省部分地区10个奶牛场共1 440份乳牛粪便样品进行显微镜检测,之后对隐孢子虫、十二指肠贾第虫和毕氏肠微孢子虫进行PCR鉴定。镜检结果显示:10个奶牛场寄生虫总感染率为47.64%(686/1 440),共检测出9类肠道寄生虫即球虫、十二指肠贾第虫、隐孢子虫、阿米巴原虫、圆线虫、鞭虫、贝氏莫尼茨绦虫、吸虫和纤毛虫,其中优势感染种类为球虫与阿米巴原虫,感染率分别为24.86%和24.65%;另外,不同年龄段乳牛寄生虫感染率及感染种类均有差异,断奶后犊牛感染率最高(62.29%),犊牛感染的寄生虫优势种类为球虫而育成牛和成年牛为阿米巴原虫。PCR检测结果显示:隐孢子虫、十二指肠贾第虫和毕氏肠微孢子虫的感染率分别为4.38%、2.20%和8.19%。此次调查结果表明,广东省部分地区奶牛肠道寄生虫感染比较普遍,同时也存在人兽共患病原隐孢子虫、十二指肠贾第虫和微孢子虫的感染,因此应加强该地区奶牛的饲养管理和肠道寄生虫的防控。     

三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查

根据GenBank登录的PRRSVORF7、PCV 2ORF1基因及PRVTK基因的核苷酸序列设计合成引物 ,建立了分别用于检测PRRSV、PRV及PCV 2的RT PCR及PCR方法。应用该方法对 77份可疑病料进行了检测 ,以调查猪群中PCV 2与PRRSV和 (或 )PRV混合感染情况。结果表明 ,2 4份样品表现为PRRSV与PCV 2混合感染 ,占样品总数的 31.2 % ;17份样品检测为PRRSV与PRV混合感染 ;9份样品表现为PCV 2与PRV混合感染 ,占 11.7% ;另外 ,还有一定比例的三重感染 ,共 8个样品 ,占 10 .4 %。结果显示 ,猪群中PRRSV、PRV与PCV 2的混合感染现象比较普遍     

陕西省部分地区鸡肠道寄生虫感染情况的调查

为调查陕西省鸡肠道寄生虫的感染情况,采用饱和盐水漂浮法和希塞氏糖溶液漂浮法,对陕西省6个地区的18个养鸡场共336份粪便样品中的寄生虫卵/卵囊进行了检测。初步鉴定了这些地区鸡的粪便中存在艾美耳球虫卵囊、隐孢子虫卵囊、鸡异刺线虫卵和鸡蛔虫卵,其感染率分别为44.94%、0.89%、25.30%和1.19%。为鉴定隐孢子虫种别,以基于18SrRNA基因的巢式PCR对分离的隐孢子虫卵囊进行种类鉴定,结果发现,3份样本中所发现的隐孢子虫均为贝氏隐孢子虫。本研究结果表明,陕西省这6个地区鸡肠道寄生虫感染较为普遍,尤以球虫和异刺线虫的感染率较高。     

同时检测五种引起猪繁殖障碍的病毒的多重PCR的建立

为建立一种能同时检测5种引起猪繁殖障碍的病毒的多重PCR方法,分别针对各病毒的保守序列设计了4对特异性引物,其中3对分别用于扩增猪瘟病毒(CSFV)E2基因、非洲猪瘟病毒(ASFV)VP72基因、伪狂犬病病毒(PRV)gB基因的目的片段;针对NSP2基因设计的1对引物用于区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)。通过对反应条件的优化,建立了快速检测CSFV、ASFV、PRV、PRRSV和HP-PRRSV的多重PCR方法。敏感性试验结果显示,该多重PCR对这5种病原核酸的最低检测量分别为2.10×103(HP-PRRSV),1.30×103(PRRSV),1.09×104(CSFV),1.50×103(ASFV)和8.97×102(PRV)copies/μL。对49份临床样品的检测结果显示,它们的混合感染率为51%(25/49)。该方法对阴性样本的扩增结果均为阴性,并且无交叉反应性,表明该方法特异性良好,具有快速、灵敏且成本低等优点,能够对猪繁殖障碍病毒病的单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断,并对其流行病学调查具有深远意义。     

延边地区牛瑟氏泰勒虫病的分子流行病学调查

为了解吉林省延边地区牛瑟氏泰勒虫病的流行情况,分别采用血涂片染色镜检法和PCR方法对采自延边地区的206份牛血液样本进行了牛瑟氏泰勒虫病的分子流行病学调查。结果显示,PCR检测的阳性率为62.6%,显著高于血涂片染色镜检法检测的阳性率(17.5%)。采用统计学分析方法对PCR检测的206份血液样本进行了不同地区、不同年龄、不同品种及饲养方式的比较;结果,不同地区之间和不同品种之间瑟氏泰勒虫感染率差异不显著(P>0.05);而不同年龄阶段之间和不同饲养方式之间牛瑟氏泰勒虫感染率差异显著(P<0.05)。结果表明,吉林省延边地区是牛瑟氏泰勒虫病的流行地区。     

西藏部分地区马属动物肠道寄生虫的流行病学调查及毕氏肠微孢子虫的基因型鉴定

为获悉西藏地区马属动物肠道寄生虫的感染情况,采集西藏4个地区马属动物粪便样品111份,采用卢戈氏碘液法和饱和蔗糖溶液漂浮法,检测到6种寄生虫,感染率分别为:圆线虫82.88%(92/111)、球虫10.81%(12/111)、阿米巴原虫17.12%(19/111)、马副蛔虫12.61%(14/111)、鞭虫2.70%(3/111)和结肠小袋纤毛虫4.50%(5/111),检测到的寄生虫总体感染率为88.29%(98/111)。另对所有样品基于毕氏肠微孢子虫ITS位点进行巢式PCR扩增,检测到毕氏肠微孢子虫的感染率为6.31%(7/111),共鉴定出3种基因型:1个已知基因型Ebp C(5/7)以及2个新基因型,分别命名为XZM1(1/7)和XZM2(1/7)。结果表明,西藏马属动物肠道寄生虫感染情况严重,尤其是圆线虫的感染率较高,检测到毕氏肠微孢子虫的3种基因型,系统发育分析中基因型XZM1归类于具有一定人兽共患风险的第2群,基因型Ebp C和XZM2属于具有高度人兽共患风险的第1群,证实该地区马属动物是毕氏肠微孢子虫的储存宿主,且在其传播过程中扮演着重要的角色。     

小鼠诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在利用巢式RT-PCR技术,建立高效检测小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的方法。通过Gen Bank上公布的一系列小鼠诺如病毒的基因序列,设计内、外各一对特异性引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式RT-PCR检测方法,并对临床样品进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法特异性好,最低检出量为1×102copies/L,高于使用参考引物RT-PCR的最低检出量1×105 copies/L,对临床样品检出率为73%,高于使用参考引物普通RT-PCR的检出率(60%),与RT-qPCR方法检出率一致。结果表明,本研究成功建立了一种检测小鼠诺如病毒的巢式RT-PCR方法,并能快速、高效地应用于临床样品的检测,为小鼠诺如病毒的诊断和检测提供了有力的手段。     

三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立

为同步检测引起奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原,本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因(Nc-ITS1)、布氏杆菌16S rRNA基因(Ba-16S rRNA)及弓形虫529 bp重复序列基因(Tg-529 bp)的特异性巢式PCR引物,建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式PCR方法。结果显示,多重巢式PCR对Nc-ITS1、Ba-16S rRNA及Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380 bp、245 bp。外引物退火温度为57℃,内引物为53℃;Taq酶、dNTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L;Nc-ITS1和Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4 m ol/L,Ba-16S rRNA为0.2 mol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102 copies/L,对Tg-529 bp达3×101 copies/L,对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带,表明该多重巢式PCR方法具有良好的敏感性和特异性。利用该方法对86份临床样品进行检测,结果显示新孢子虫阳性样品26份,布氏杆菌阳性样品2份,弓形虫阳性样品1份,其中新孢子虫和布氏杆菌均为阳性的样品1份,与单巢式PCR检测结果一致。结果表明,建立的多重巢式PCR方法可以用来对致奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原进行快速、准确地检测。     

犬圆环病毒及犬细小病毒双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测犬圆环病毒(CanineCV)和犬细小病毒(CPV)的方法,根据CanineCV和CPV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增CanineCV和CPV的片段大小分别为984和668 bp。并将反应条件进行优化,建立了CanineCV和CPV的双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增CanineCV和CPV的目的条带,且未扩增出其他犬胃肠道病原;CanineCV和CPV的最低检出限分别为85.7和312 copies/L。对采集自广西地区的223份临床样品的检测结果显示,CanineCV的阳性率为2.24%(5/223)、CPV的阳性率为5.38%(12/223),后者与常规PCR检测方法相一致。结果表明,建立的双重PCR方法可以用于CanineCV和CPV的检测和流行病学调查。     

江苏省七个县域猪嵴病毒感染的流行病学调查

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计1对特异性引物,用RT-PCR方法对从江苏省7个县域采集的220份猪腹泻肛拭样品进行检测,调查猪嵴病毒在江苏省的流行情况,以进一步丰富猪嵴病毒在我国的流行病学调查数据。所有样品猪嵴病毒感染阳性率达52.73%(116/220),阳性猪场占79.41%(27/34)。对5个不同来源阳性样品中获得的3D基因序列进行测序分析,结果显示,5株猪嵴病毒3D序列与GenBank中已知的国内外猪嵴病毒的相应序列在核苷酸水平具有较高同源性。调查结果表明,猪嵴病毒在江苏省部分县域腹泻猪群中有较高感染率,但猪嵴病毒在其中的作用尚有待进一步的研究。     

猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够准确、快速地鉴别猪肠病毒G型的诊断方法,本研究参考猪肠病毒G型的3D基因序列设计1对特异性引物,扩增片段预计大小约为104 bp,将3D基因片段克隆到pMD18-T载体上的阳性重组质粒作为标准品,建立猪肠病毒G型的实时定量PCR检测方法,并应用到临床样品的检测。研究结果显示,该方法设计的引物具有高度的特异性;标准曲线的Cq值与质粒标准品模板在2.92×10^8copies/μL^2.92×10^2copies/μL范围内,呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-4.023;组内与组间重复性试验显示变异系数很小,在0.26%~1.57%之间。该方法的最低检测限量可达2.92×10 copies/μL。使用本方法对2017-2019年广西部分地区的猪场临床腹泻粪便样品进行检测,猪肠病毒G型阳性检出率为18.42%,说明广西部分地区的猪场存在猪肠病毒G型的感染。本研究成功建立了猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法,可用于猪肠病毒G型感染的临床检测。     

PCR检测鸡毒霉形体和鸡滑液囊霉形体的研究

根据禽霉形体 16SrRNA的基因序列设计、合成了 1对引物 ,用这对引物对鸡毒霉形体 (Mycoplasmagallisep ticum ,MG)和鸡滑液囊霉形体 (Mycoplasmasynoviae ,MS)菌株DNA进行PCR扩增 ,得到了与预期大小相一致的约 5 80bp的PCR产物 ,而这对引物对其他禽病病原DNA或RNA模板的扩增结果为阴性。PCR方法对MG和MS的最小检出量分别为 2 pg和 3pg。应用已建立的PCR方法检测MG人工感染样品和临床样品 ,从人工感染样品中均检测到MG ,临床样品的MG阳性检出率为 10 .2 5 % ,高于常规分离培养的阳性检出率