enJSRV囊膜蛋白激活绵羊绒毛膜滋养层细胞中MAPK信号通路的研究

为初步探究内源性绵羊肺腺瘤病毒(en JSRV)囊膜蛋白(Env)在绵羊绒毛膜滋养层细胞中的作用机制,利用免疫组织化学染色法检测enJSRV-Env在绵羊胎盘中的主要表达区域,继而瞬时转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRV-env到绵羊绒毛膜滋养层细胞,并加入Erk抑制因子PD 98059、p38抑制因子SB 203580及JN K抑制因子SP600125,同时转染重组质粒至293T细胞中作为对比。利用W estern-blot分别检测2种细胞中Erk1/2、p38和JNK蛋白激酶磷酸化水平的变化。免疫组织化学染色结果显示,enJSRV-Env主要表达于绵羊胎盘中绒毛膜滋养层细胞。Western-blot结果显示,绵羊绒毛膜滋养层细胞中,转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRV-env组中p-Erk1/2、p-p38和p-JNK的表达量均显著高于对照组和加入抑制因子组(P0.05);加入3种抑制因子后,3种蛋白激酶的磷酸化水平较转染组显著降低。293T细胞中,转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRVenv组中p-p38的表达量显著高于对照组(P0.05),p-JNK的表达量极显著高于对照组(P0.01)。因此,enJSRV-Env激活了绵羊绒毛膜滋养层细胞中MAPK信号转导通路。再通过与293T细胞的结果对比可知,enJSRV-Env在这2种细胞中的作用机制有所不同。本研究为今后继续深入探究en JSRV-Env的作用机制提供了新的思路和依据。     

绵羊胎盘滋养层细胞的体外培养与鉴定

为建立一种稳定、方便地获得较高纯度的绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法,为后续的细胞转染和RNA干扰试验提供细胞学基础,采用组织块法培养滋养层细胞,消化差速法纯化细胞,相差显微镜观察滋养层细胞的形态学特点,应用常规HE染色和免疫组织化学染色、透射电镜及PCR技术鉴定细胞来源。结果显示,倒置相差显微镜下,可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。免疫组织化学染色显示,细胞角蛋白染色阳性细胞占90%以上,波形蛋白染色呈阴性;透射电镜可观察到滋养层细胞所特有的结构;台盼蓝排斥试验检测细胞活力,存活率超过95%,细胞活力良好。常规RT-PCR技术可扩增出滋养层细胞所分泌的特有的干扰素蛋白-1基因片段。证实该方法可以有效获得较高纯度的、具有生物学活性的绵羊绒毛膜滋养层细胞,为本实验室后续的体外研究提供试验基础。     

妊娠绵羊子宫内膜组织内源性反转录病毒及其受体HYAL2基因表达水平的检测

为了探究内源性反转录病毒(enJSRV)及其受体HYAL2在妊娠蒙古绵羊子宫内膜形成和发育过程中的作用,运用TaqMan实时荧光定量PCR和组织原位杂交技术对其在不同妊娠时期(30、50、70、90、110和130d)蒙古绵羊子宫内膜中的表达规律和分布定位进行了研究。实时荧光定量PCR结果显示,enJS-RV及其受体HYAL2在蒙古绵羊子宫内膜的不同妊娠时期均有表达,通过SPSS统计学软件分析可以看出,妊娠蒙古绵羊子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达于妊娠第30和50天相对较高,70～130d均低于对照组(30d),且差异都极显著,enJSRV与其受体HYAL2mRNA之间亦无线性相关性。原位杂交结果显示,enJSRV及其受体HYAL2mRNA在妊娠第30、50和130天蒙古绵羊子宫内膜的腔上皮细胞、腺上皮细胞、血管内皮细胞、间质及滋养层巨型双核细胞中均有阳性信号表达。表明enJSRV及其受体HYAL2表达于上皮细胞及上皮细胞来源的滋养层巨型双核细胞中,揭示enJSRV及其受体HYAL2在子宫形成过程中和系统防御中可能发挥重要作用。     

绵羊子宫内膜上皮细胞的培养鉴定及enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达

为了分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞并瞬时表达内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白及其受体(Hyal2),采用酶消化法分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞,差速消化法纯化细胞。应用角蛋白抗体对细胞进行免疫细胞化学鉴定。扩增enJSRVenv基因及其受体Hyal2基因,并构建真核表达质粒,同时在Hela细胞中瞬时表达。结果显示,细胞在相差显微镜下呈明显的上皮样细胞形态,同时细胞角蛋白染色阳性细胞占90%以上。成功构建了真核表达质粒pcDNA4-enJSRVenv及pcDNA4-Hyal2。Western-blot结果显示,真核表达质粒在HeLa细胞中被成功表达。本研究建立了一套高效、简便的子宫内膜上皮细胞培养方法,同时为进一步探究enJSRV囊膜蛋白的结构和功能奠定了试验基础。     

超声作用对绵羊胎儿成纤维细胞转染效率的影响

为研究超声波对经脂质体介导的绵羊胎儿成纤维(sheep fetal fibroblasts,SFF)细胞转染效率的影响,用不同频率的超声波在不同时间内辐射经脂质体介导的SFF细胞,转染48h后收集细胞,用RT-PCR检测目的基因,台盼蓝染色检测细胞活性。转染后用G418挑选转基因单克隆细胞,计算转染率。结果显示,对细胞、质粒和脂质体的混合液共同超声辐射(时间60s,超声频率为2.5MHz)后转染,转染率要明显高于未超声辐射的细胞和先转染后超声辐射的细胞,并且细胞的存活率较高。结果表明,超声辐射不仅能改变细胞质膜的通透性,还能够提高脂质体介导的基因转染效率,增强基因介导的特异性和靶向性。     

非洲猪瘟病毒NP419L基因shRNA表达质粒的构建与筛选

为构建非洲猪瘟病毒(ASFV)shRNA表达质粒,以PCR扩增出非洲猪瘟病毒NP419L基因,并插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组真核表达质粒pNP419L-GFP,将其转染NIH-3T3细胞,NP419L-GFP融合基因在细胞中获得表达。针对NP419L基因设计并合成5对干扰序列,将其连接到RNAi表达载体pSuper中,构建干扰质粒pSuper-shNP419L-A,B,C,D,E,将质粒pNP419L-GFP和pSu-per-shNP419L-A,B,C,D,E分别共转染NIH-3T3细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析干扰效率。结果显示,5个干扰质粒均能抑制NIH-3T3细胞中NP419L-GFP融合基因的表达,其中pSuper-shNP419L-A,B的抑制效果较好,在87%以上,与pSuper-shNP419L-C,D,E之间均存在显著性差异(P<0.05)。表明,本试验成功构建出针对ASFV NP419L基因的RNA干扰质粒,并筛选出了有效沉默NP419L基因的干扰序列,为进一步体内试验研究奠定了基础。     

绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜基因的定向克隆与融合表达

根据绵羊肺腺瘤病毒(SJRV) NM株基因组全序列,设计了 1 对包含囊膜(env)基因在内的引物,并在5′端分别设计了HindⅢ和 BamHⅠ酶切位点,利用 PCR技术扩增 env基因,通过连接反应将其克隆于pET 30b表达载体上。序列分析表明,env基因全长 1 836 bp,编码 612 个氨基酸残基;构建表达重组质粒env pET 30b,转化大肠埃希氏菌 BL21,经 IPTG于 37 ℃诱导培养,SDS PAGE电泳分析表明,表达的env基因融合蛋白分子质量约为69 ku。     

绵羊痘病毒E3L基因在Vero细胞中的表达

为了构建组成型表达绵羊痘病毒E3蛋白的真核表达载体,并检测E3蛋白在Vero细胞中瞬时表达的情况,将绵羊痘病毒E3L基因亚克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-E3L,经酶切和测序鉴定正确后转染至Vero细胞,利用Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)对E3蛋白的表达水平进行鉴定。结果显示,转染后第48小时可检测到E3L基因高水平的表达。这一研究结果为进一步研究绵羊痘病毒E3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

p53基因RNA干扰载体的构建及其在ST细胞系中的稳定表达

利用质粒介导的RNA干扰技术,建立稳定沉默p53基因的ST细胞系。通过改造p EGFP-C1载体,构建了猪源U6启动子启动编码p53 sh RNA序列的载体,将其转染ST细胞,用G418筛选细胞,并分析获得细胞的生长特性。RT-PCR和Western-blot结果显示,质粒介导的sh RNA有效地沉默了p53基因的表达;流式细胞术和细胞生长特性分析结果显示,与对照组细胞相比,p53基因沉默组ST细胞处于S期的细胞数量增多,而且p53基因沉默组ST细胞生长较快。本研究结果证实质粒介导的sh RNA高效、稳定地沉默了ST细胞中p53基因的表达。     

鹅γ-干扰素基因真核表达载体的构建及在幼仓鼠肾细胞中的表达

将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),得到真核表达质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ,经测序鉴定后,在室温条件下,质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ浓度20μg/mL,体积400μL,幼仓鼠肾细胞(BHK-21)细胞密度1×106/mL,电穿孔仪参数设为电压425 V、电容25μF、连续脉冲2次转染BHK-21细胞,待细胞贴壁后经过浓度为600μg/mL的G418连续筛选14 d后,出现抗性细胞克隆,将阳性BHK-21细胞上清液进行Western-blot鉴定,检测结果证明鹅IFN-γ在BHK-21细胞中得到表达。