牦牛胎儿成纤维细胞的分离培养

采用30d胚龄左右的牦牛胚胎,用2种不同的消化液消化后,将所得的牦牛胎儿成纤维细胞(yak embryonic fibroblasts,YEF)培养于不同血清含量的RPMI1640培养液中,并接种于2种不同材质的培养瓶表面,对YEF的分离方法、培养所需胎牛血清(FBS)添加量和不同基质表面对YEF生长的影响进行了研究。结果表明,含150 mL/L FBS的RPMI1640培养基最适合YEF生长,可传代27次以上;经用RPMI1640和D-Hank’s液配制的2．5 g／L胰蛋白酶消化,所得的YEF的细胞活率差异不显著(P>0．05),其原代细胞在含100 mL／L胎牛血清的RPMI1640培养液中的贴壁率差异极显著(P<0．01);不同生长基质对YEF的形态没有显著影响。     

不同培养系统牛体外受精囊胚的质量评价

采用双重荧光分染方法 ,结合免疫外科手术 ,对来自TCM 199和SOF培养系统的牛体外受精囊胚质量进行了评价。结果显示 ,TCM 199培养系统的囊胚发育率为 31.9% (335 / 10 74 ) ,平均细胞总数为 73.1,内胚团细胞数为 16 .8,其中生存细胞占 99.5 % ;SOF培养系统的囊胚发育率为 2 0 .9% (2 4 8/ 1186 ) ,平均细胞总数为 5 6 .2 ,内胚团细胞数为 11.3,其中生存细胞占 96 .5 %。证实 ,使用TCM 199生产的囊胚质量和囊胚发育率优于SOF培养系统。     

透明质酸酶对牛卵母细胞孤雌激活的研究

在37-39℃50 mL/L CO2条件下,用含80 mL/L发情牛血清及50 mL/L犊牛血清的M199成熟培养液培养牛的A、B级卵丘-卵母细胞复合体(COCs),18-22 h后以无血清的TCM199培养液洗涤3次,用透明质酸酶消化吹打脱去卵丘细胞,以无血清的M199培养液洗涤3次,移回成熟培养液中培养.结果,卵细胞于成熟后第3 d开始出现卵裂,第5 d卵裂率达到37%,第9 d囊胚率达5%-9%.表明透明质酸酶可以促使成熟的牛孤雌卵母细胞激活并发育至囊胚.     

不同培养液对牛孤雌生殖胚胎和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

采用体外成熟的牛卵母细胞 ,经 5 μmol/LIonomycin 5min和 2mmol/L 6 DMAP 5 μg/mLCCB 4h激活 ,分别在TALP M 199(TM ,1∶2 )、BMOC M 199(BM ,1∶2 )和CR1aa培养液内培养 ,2 4h和 3 6h各组卵母细胞的卵裂率分别为5 6.4%、5 5 .6%、5 3 .6%和 72 .0 %、75 .9%、79.0 % ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 8d后囊胚发育率分别为 18.2 %、2 1.4%和 2 9.3 % ,CR1aa内培养孤雌生殖胚的囊胚发育率显著高于TM (P <0 .0 1)。皮肤成纤维细胞构建的重组胚经同法激活后 ,分别在TM、BM和CR1aa内培养 ,2 4h和 3 6hBM和CR1aa内重组胚的卵裂率显著高于TM (4 9.7%、49.8%比 2 0 .5 % ;74.1%、73 .2 %比 5 0 .0 % ) (P <0 .0 1) ;虽然培养 8d后各组胚胎的囊胚发育率无显著差异 ,但CR1aa内重组胚的囊胚发育率稍高 (12 .3 %比 9.8%、11.5 % )。结果表明 ,CR1aa更适合孤雌生殖和体细胞核移植胚胎的体外培养。     

神经生长因子对牛腔前卵泡体外培养的影响

用改良的McCoy’s 5a培养液(含 3 mmol/L L-谷氨酰胺、1 g/L BSA、29 ng/mL睾酮、2.5μg/mL转铁蛋白、100 ng/mL胰岛素和4 ng/mL硒),在96孔培养板中,每孔250μL培养液条件下,研究了神经生长因子(NGF)对牛腔前卵泡体外发育的影响。结果表明:在培养液中添加 3种不同浓度(4、6、8 IU/mL)NGF对体外培养的d<60μm腔前卵泡有促进生长的作用。在体外培养10 d时,3种不同浓度NGF组的d<60μm腔前卵泡及其卵母细胞直径平均增长值显著高于对照组,但对60μm130μm的腔前卵泡作用不显著。同时,不同浓度的 NGF显著提高了d<60μm腔前卵泡的发育率。     

紫外线照射对牛孤雌激活卵母细胞和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

分析了紫外线 (ultraviolet,UV)照射对牛孤雌激活卵母细胞和体细胞核移植胚胎卵裂和体外发育的影响。结果发现 ,经UV照射 2 0s和 40s的卵母细胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚发育率都极显著低于UV照射 0s和 1 0s的卵母细胞 (P <0 .0 1 ) ,表明UV照射卵母细胞超过 2 0s降低了孤雌激活胚胎的卵裂和体外发育潜力。核移植中UV照射卵母细胞 2 0s后 ,重组胚的卵裂率极显著低于卵母细胞照射 0s和 1 0s时所构建的重组胚 (P <0 .0 1 ) ,但囊胚发育率无显著差异 (P>0 .0 5 ) ;而UV照射卵母细胞 40s时 ,所构建的重组胚的卵裂率和囊胚发育率都明显低于其他各组 ,表明超过 2 0s的UV照射显著降低了重组胚的卵裂和体外发育潜力。研究结果表明 ,核移植中用UV指导卵母细胞去核时UV照射时间应控制在 2 0s以内 ,UV照射 1 0s对核移植胚胎的发育不产生任何负面影响     

不同化学激活剂对小鼠卵母细胞的激活效果

为探讨不同激活剂的卵母细胞孤雌激活效果及激活胚体外发育情况,用乙醇、Ca-A23187、SrCl2、6-DMAP及CB分别对小鼠卵母细胞进行了激活处理。结果显示,70 mL/L乙醇刺激小鼠卵母细胞时,以激活5~7 min的激活效果及孤雌胚发育较好,桑囊胚发育率可达29.11%;用SrCl2激活小鼠卵母细胞时,6~10 mmol/L为最佳处理浓度,3~6 h为最佳激活时间,桑囊胚发育率可达16.67%;以70 mL/L乙醇激活5 min,再用2 mmol/L 6-DMAP 5μg/mL CB激活3 h效果最佳,桑囊胚发育率高达35.77%。研究证实,小鼠卵母细胞经乙醇、6-DMAP和CB等复合激活后能较好地发育。     

牛附红细胞体体外培养试验

用RPMI 164 0、M 199、D MEM 3种培养液作为基础培养基 ,再分别按体积分数加入 40 %的犊牛血清 ,采用普通恒温培养箱 (3 7℃ )进行牛附红细胞体体外培养。结果表明 ,牛附红细胞体在RPMI 164 0培养基中 ,每 12h更换 1次培养液 ,并补充适量正常红细胞 ,获得了高达 99%的感染率 ;连续传代培养可达 44代以上。     

不同体外培养条件对家兔早期囊胚贴壁行为的影响

采集家兔自然交配后96 h的早期囊胚,以低糖DMEM 150 mL／L胎牛血清 0．1 mmoI／L非必需氨基酸 100 IU／mL青霉素 100 IU／mL链霉素为基础培养基,比较了不同胚胎处理方法、不同饲养层以及培养液中添加不同成分对兔早期囊胚贴壁和增殖的影响,以完善免胚胎干细胞的建系方法。结果表明,以胚胎分割法和链霉蛋白酶-E(proteinase E)处理掉黏蛋白及部分透明带的胚胎容易贴壁和增殖;在小鼠成纤维细胞饲养层和兔胎儿成纤维细胞饲养层上,胚胎的脱带率差别不大,但在小鼠成纤维细胞饲养层上贴壁率明显提高,且贴壁后内细胞团增殖较快;添加胰岛素、白血病抑制因子和β-巯基乙醇均利于抑制ES的分化和促进内细胞团的增殖。     

小鼠孤雌胚2-细胞阻滞的研究

为探讨小鼠孤雌胚2-细胞阻滞的机制,本试验以昆明小鼠为研究对象,通过输卵管上皮细胞和垂体细胞作为饲养层培养小鼠孤雌胚胎,分析其作用机理。小鼠卵母细胞通过70mL/L乙醇激活5min,再用2mmol/L 6-DMAP、5μg/mL CB激活3h后,分别在不同饲养层的KSOM培养液中进行培养,观察并比较各培养条件下孤雌胚胎的发育情况。结果,培养至第24小时,各组无显著差异(P>0.05),都有较高卵裂率。培养至第48小时,用两种饲养层细胞培养的孤雌胚胎4-细胞～8-细胞发育效果好,与用单独一种饲养层细胞培养相比,差异显著(P<0.05),与对照组相比,差异极显著(P<0.01);发育至桑囊胚的比例为49.4%(42/85)(P<0.01)。结果表明,含有输卵管上皮细胞和垂体细胞的KSOM培养液可有效促进小鼠孤雌胚胎的发育并通过2-细胞阻滞(通过2-细胞阻滞率为74.1%),并可进一步提高其发育率(桑囊胚率为49.4%)。     

猪和兔附红细胞体的体外培养

用RPMI1640和小牛血清按不同比例混合作为体外培养猪和兔附红细胞体的基础培养基,同时以去掉红细胞上自然感染的附红细胞体后的红细胞泥作为培养附红细胞体的寄生载体,进行猪和兔附红细胞体的体外培养。培养结果表明,以 RPMI1640 与小牛血清按 6∶4 比例混合,同时选用兔红细胞泥作为载体的培养效果最佳,接种感染了附红细胞体的猪、兔阳性红细胞后 24 h生长达到高峰,感染率分别为40.2%和31.0%,而采用猪红细胞泥作为培养载体时红细胞感染率无明显升高。     

低血清培养PK-15细胞系对TGEV增殖规律的研究

为降低疫苗生产综合成本,本研究探讨了以低血清培养基(M08011)替代常规细胞培养基(DMEM)的可行性。本研究依次采用含100、80、50、30、20、10、0mL/L血清的低血清培养基(M08011)驯化PK-15细胞,并考察猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)在低血清培养的PK-15细胞系中的增殖规律。结果显示,驯化后的PK-15细胞在含100、80、50、30、20 mL/L的低血清培养基中生长状态良好,与常规培养基所培养的PK-15细胞无差异。低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20 mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种TGEV后,TGEV的TCID50为10^-4.97/100μL,与常规条件培养的TGEV的TCID50为104.88/100μL相比,差别不明显。TGEV接种PK-15细胞,低血清培养基中血清浓度降低至20 mL/L,毒价未受到影响。结果表明,本研究建立的PK-15细胞及TGEV低血清培养体系可初步应用于TGEV的增殖培养,为相关疫苗研发奠定了基础。     

中药对鸡新城疫灭活疫苗免疫效果的影响

手工乳化制备含 2 0 g/L人参皂甙、4 0g/L海藻多糖、4 0 g/L黄芪多糖、4 0 g/L芦荟多糖的鸡新城疫灭活油乳剂疫苗 ,注射免疫 2 1日龄粤黄鸡 ,即日起连续 3d按体重胸肌注射环磷酰胺 4 0mg/kg ,每日 1次 ;免疫后第 7、14、2 1、2 8、4 2d采血检测鸡新城疫HI抗体效价 ,免疫后第 14、2 8d采血检测红细胞CR1受体 (RBC CR1)花环率、免疫器官指数和血清超氧化物歧化酶 (SOD)活性。结果表明 ,人参皂甙、海藻多糖在免疫后期能提高鸡新城疫HI抗体效价 ,而黄芪多糖、芦荟多糖作用不明显 ;人参皂甙、黄芪多糖、芦荟多糖能显著提高鸡RBC CR1花环率 (P <0 .0 5 ) ,海藻多糖作用不显著 (P >0 .0 5 ) ;海藻多糖、芦荟多糖能显著提高血清SOD活性 (P <0 .0 5 ) ,人参皂甙、黄芪多糖作用不显著 (P >0 .0 5 ) ;人参皂甙、海藻多糖能显著提高免疫器官指数 (P <0 .0 5 ) ,黄芪多糖、芦荟多糖作用不显著 (P >0 .0 5 )。     

微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型的建立及不同阶段虫体形态的观察

利用人回盲肠癌(HCT-8)细胞作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养,观察细胞的生长状况;在培养细胞中加入1×105个经活力检测的微小隐孢子虫卵囊,培养72h后用荧光标记的隐孢子虫卵囊、子孢子染色试剂盒Crypt-a-Glo和Sporo-Glo进行染色,观察不同发育阶段的隐孢子虫形态。结果显示,在六孔培养板中接种10×105个细胞后,24h后长成80%～100%单细胞层,可以用来接种微小隐孢子虫。培养72h后观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。结果表明,成功建立了微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型。     

印楝油对兔疥螨幼虫的体外杀螨活性

将兔疥螨幼虫置于聚苯乙烯小平皿中,分别加入不同浓度的印楝油液体石蜡溶液,以天然除虫菊酯和阿维菌素为阳性对照,蒸馏水和液体石蜡为阴性对照,观察记录不同时间段的螨虫死亡数,以死亡率、半数致死时间(LT50)和半数致死浓度(LC50)为指标评价了印楝油对兔疥螨幼虫的离体杀螨活性。结果显示,未稀释的印楝油能在25 min内杀死所有幼螨,其杀螨活性显著强于500 g/L的天然除虫菊酯(825 min,P<0.01),而与25 g/L的阿维菌素无显著差异(19 min,P>0.05);500、250和125 mL/L印楝油对兔疥螨幼虫的LT50分别为1、2、5 h;24 h的LC50和LC95分别为2.908和12.018 mL/L。结果证实,印楝油对兔疥螨幼虫具有较好的离体杀螨活性。     

狂蝇蛆病对驯鹿体内抗氧化系统的影响

为探讨驯鹿狂蝇蛆病与机体氧自由基代谢的关系,分别对感染驯鹿和健康驯鹿血清中的微量元素硒(Se)、锌(Zn)、铜(Cu)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和脂质过氧化终末产物丙二醛(MDA)的含量进行了测定。结果表明,感染组驯鹿血清Se含量极显著低于对照组(P<0.01),而血清Zn、Cu含量差异不显著;感染组驯鹿血清GSH-Px活性极显著低于对照组(P<0.01);SOD活性显著低于对照组(P<0.05),CuZn-SOD显著低于对照组(P<0.05);CAT活性差异不显著;MDA含量显著高于对照组(P<0.05)。表明机体患病后产生大量氧自由基,导致抗氧化能力降低,引发脂质过氧化损伤。     

不同细胞因子对水牛原始生殖细胞传代培养的影响

为探讨不同细胞因子对水牛原始生殖细胞(PGCs)传代培养的影响,将PGCs分别采用A、B、C、D、E、F和G共7种培养基进行培养,即A组:基础液+10 ng/mL白血病抑制因子(LIF)+10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);B组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF;C组:基础液+20 ng/mLLIF+10 ng/mL bFGF;D组:基础液+20 ng/mL LIF;E组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF+20ng/mL干细胞因子(SCF);F组:基础液+20 ng/mL LIF+40 ng/mL bFGF+40 ng/mL SCF;G组(对照组):基础液。将机械法分离的PGCs小集落接种到水牛胎儿成纤维细胞(BEF)饲养层上进行传代培养。结果,原代时,A、B、C、D、E和F组的克隆数目都显著高于对照组(P<0.05),其中E和F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05),而与B、C、D组差异均不显著(P>0.05);1~8代时,B、C、D、E、F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05);对照组传代数仅为2代,A组为5代,而B、C、D、E和F组均为8代以上。结果表明,在传代过程中,LIF起主要作用,20 ng/mL的LIF浓度可以满足水牛PGCs传代培养的需要。