鸭MAPK1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

为研制鸭丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)单克隆抗体,从樱桃谷鸭脾样品扩增鸭MAPK1基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建鸭MAPK1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白,经纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA筛选分泌抗鸭MAPK1的单克隆杂交瘤细胞株,进行3次亚克隆纯化后,制备小鼠腹水。采用间接ELISA测定腹水效价,用Western-blot检测其特异性,并进行单克隆抗体的亚类鉴定。测序结果表明,鸭MAPK1基因编码区全长1 107bp,编码369个氨基酸。SDS-PAGE检测结果表明,本研究获得了可溶性的42ku的鸭MAPK1重组蛋白。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,得到2株抗鸭MAPK1的阳性杂交瘤细胞株,腹水效价均达到1∶12 800以上,均为IgG1亚类。Western-blot分析结果表明,制备的单克隆抗体具有良好的免疫反应特异性。以上结果表明,本研究成功制备了抗鸭MAPK1的单克隆抗体,为进一步研究其在先天免疫反应中的作用奠定了基础。     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

牛型布鲁氏菌铁离子转运蛋白基因的克隆及其表达蛋白的生物学特性

将通过PCR技术扩增的牛型布鲁氏菌铁离子转运蛋白(Brucellaferric uptake,BfuA)基因克隆至表达载体pCold TF中,构建重组表达质粒pCold TF-BfuA,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,在IPTG诱导下表达出大小约为100ku的融合蛋白His-BfuA。Western-blot分析表明,His-BfuA能与布鲁氏菌阳性牛血清发生特异性反应,表明BfuA具有免疫原性。用His-BfuA作为包被抗原,对35份布鲁氏菌阳性牛血清进行ELISA检测,结果所有被检血清均为阳性反应,表明BfuA为潜在的可用于牛型布鲁氏菌诊断的靶蛋白。此外,对BfuA的亚定位结果表明,BfuA为膜蛋白;对His-BfuA的纤连蛋白结合活性及纤连蛋白溶酶原结合活性的试验结果表明,His-BfuA不具有上述2种活性。上述结果为牛型布鲁氏菌病诊断方法的建立及亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

牛型布鲁氏菌A19株外膜蛋白OMP2b的表达及鉴定

根据GenBank中的牛型布鲁氏菌基因序列,设计了1对特异性引物,以A19菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出外膜蛋白OMP2b的全长基因,将OMP2b经T-A克隆后进行了序列测定和分析。结果表明,OMP2b全长1 128bp,编码376个氨基酸。将OMP2b定向克隆至表达载体pCold TF中,构建重组表达质粒pCold TF-OMP2b,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白His-OMP2b。SDS-PAGE分析结果显示,His-OMP2b约为93ku,与预期大小一致,表明His-OMP2b表达成功;经Wes-tern-blot分析,His-OMP2b能与牛型布鲁氏菌A19株全菌兔抗血清发生特异性反应,表明His-OMP2b具有免疫反应性。     

布鲁氏菌延胡索酸水合酶与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原的结合活性

依据牛型布鲁氏菌(Brucella abortus)延胡索酸水合酶(fumarate hydratase classⅠ,Fumhy)基因序列设计1对特异性引物,以牛型布鲁氏菌A19株基因组为模板,通过PCR扩增Fumhy基因的开放阅读框,连接到pMD18-T Simple载体上后进行序列测定和分析;将Fumhy定向克隆到表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-Fumhy,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下,进行Fumhy蛋白的表达,对表达的Fumhy蛋白进行免疫原性、与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性检测,研究Fumhy蛋白的免疫原性及相关的生物学活性。测序结果表明,Fumhy基因全长1 620bp,编码539个氨基酸;成功获得带有His标签的Fumhy重组蛋白His-Fumhy,大小为59ku,与预期结果相符合。Western-blot检测结果表明Fumhy蛋白具有免疫原性,且具有与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性。由此推测Fumhy蛋白可能参与布鲁氏菌在体内的感染过程。     

逆转录病毒载体

逆转录病毒载体丁铲，于圣青（江苏省家禽科学研究所扬州２２５００３）逆转录病毒（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）是迄今为止所发现的最复杂的病毒之一，它能自发地进入到许多脊椎动物的生殖细胞中，病毒基因可以与宿主结构基因以同样的方式进行稳定的遗传。如鸡基因组上内源性...     

ClassⅠ新城疫病毒强毒株主要结构蛋白特异性抗体的研制

以新城疫病毒(NDV)ClassⅠ强毒分离株9a5b尿囊液、原核表达的NP、P、M、HN、F五种蛋白为免疫原,接种6周龄BALB/c小鼠制备抗体,用血凝抑制试验(HI)、间接免疫荧光试验(IFA)、细胞中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-blot方法共同检测所获得的各类抗体。结果显示,成功制备获得了NDV各结构蛋白多抗及12株NDV特异性单抗。免疫特性鉴定结果表明,在获得的12株单抗中,3H7和3H9株单抗为抗ClassⅠHN特异性单抗,仅具有IFA和HI效价,而2A8株单抗却无HI效价;其他单抗均与ClassⅡ毒株存在交叉反应。     

新城疫病毒ClassⅠ强毒株L基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法从新城疫病毒(NDV)ClassⅠ强毒株9a5b中扩增出了L基因C末端的基因片段,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,测序验证后转化入表达宿主菌BL21进行IPTG诱导表达,表达的蛋白接种8周龄BALB/c小鼠,制备L蛋白的单克隆抗体,用间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-bolt方法共同检测所获得的抗体。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为39ku的重组融合蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。多种方法筛选显示成功制备了4株单克隆抗体。免疫特异性鉴定结果表明,在所获得的单抗中,4株单抗均具有ELISA和IFA效价,且4株单抗与ClassⅠ毒株的反应均强于与ClassⅡ毒株的反应。