犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及其真核表达

为构建犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒,并在真核细胞中表达,以重组质粒pVAX1-NcAMA1为模板,PCR扩增了NcAMA1基因,以此构建了pMD18T-NcAMA1重组克隆质粒;对该重组克隆质粒进行双酶切鉴定后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pCR259中。应用脂质体介导转染法将经PCR鉴定和酶切鉴定正确的pCR259-NcAMA1重组穿梭质粒转染293细胞,应用IFAT和Western-blot技术检测了AMA1基因在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的NcAMA1基因长度为1 695bp,构建的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1能在293细胞中获得瞬时表达,表达蛋白的分子质量约为68ku。     

驽巴贝虫BC-48基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法扩增驽巴贝虫吉林分离株BC-48基因片段,将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接,重组质粒经PCR、单酶切鉴定后测序;构建BC-48的重组pGEX-4T-2表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting分析.结果显示,克隆的BC-48基因片段长610 bp,含有一个570 bp的开放阅读框,编码189个氨基酸,与GenBank中USDA株(U46551)的同源性为96.7%;表达的融合蛋白为45 ku,能被驽巴贝虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的反应原性.     

猪附红细胞体实验动物模型的建立

为建立一种合适的猪附红细胞体病动物模型,利用摘除脾和/或注射地塞米松的昆明小白鼠,以腹腔注射方式人工感染猪附红细胞体,通过血液涂片镜检、PCR检测、临床症状观察及病理剖检对感染情况进行了鉴定。结果显示,猪附红细胞体能够经腹腔注射感染昆明小白鼠,且感染鼠表现出与猪附红细胞体病相似的临床症状。结果表明,猪附红细胞体实验动物模型已成功建立,并证实啮齿类动物在附红细胞体的传播过程中发挥着重要作用。     

FTA纸片中保存的马巴贝虫DNA的PCR检测

应用PCR分别检测了保存在FTA纸片中和—20℃保存的37份马抗凝血液样本中的马巴贝虫DNA。结果显示,FTA纸片和马抗凝血液的马巴贝虫DNA检出率均为75．7% (28/37)。证实FTA纸片中的血液样本可以用于PCR检测,而且结果可靠、节省时间,便于送检和保存,有利于疾病的诊断和流行病学调查。     

猪附红细胞体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能定性与定量检测猪附红细胞体的方法,根据GenBank中猪附红细胞体的16SrRNA基因高度保守区设计了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了一种快速检测猪附红细胞体核酸载量的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法在107～101 copies/μL具有良好的线性关系(RSq=0.999)。能检测到模板的下限为30copies,灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。该检测方法与其他猪常见病病原体无交叉反应,具有良好的重复性。对临诊疑似猪附红细胞体感染猪血液进行了检测,其检出率比常规PCR方法高10%。表明该方法可用于临床上猪附红细胞体的检测及定量分析。