野生动物园不同源性VRE耐药性及REP-PCR分型研究

为了解福州市野生动物园内不同源性耐万古霉素肠球菌的耐药现状及亲缘情况,进而指导兽医临床合理用药,并对控制耐药性传播提供理论依据。用微量肉汤法对6种抗生素进行药敏试验,PCR法检测VanA、VanB、VanC1和VanC2/C3基因,并采用重复基因外回文序列PCR分析技术(REP-PCR),对分离自不同源性的耐万古霉素肠球菌进行基因多样性研究,比较菌株之间的亲缘关系。结果显示,福州市动物园内不同源性肠球菌分离到VRE共41株,耐药率高达100%,其中红霉素(100%)、土霉素(97.58%)和氯霉素(86.67%)耐药率最高;氨苄西林和万古霉素敏感率分别为92.12%和84.85%;万古霉素相关耐药基因VanA检出率为4.88%,VanB基因检出率为17.07%,VanC1基因检出率为31.71%,VanC2/C3基因检出率为39.02%;REP-PCR分型结果显示,不同来源的耐万古霉素肠球菌菌株大致可分为2~3个型,其中,分离自动物园环境的H2和H3、H1、H8和H9及分离自动物园不同动物的M9和NL6、MH5和MH8、M3、BM3和L6具有100%同源性。结果表明,动物园内肠球菌整体耐药情况较严重,耐药基因VanA、VanB、VanC1和VanC2/C3基因与多重耐药具有相关性;动物源性、环境源性和人员性VRE之间发现同源性100%的菌株,可能存在同一菌株的垂直克隆传播,不同源性VRE之间存在一定的流行病学相关性。     

肠道菌群多样性变性梯度凝胶电泳分析法的建立

采用珠磨法、冻融研磨法和酶法对粪便细菌进行裂解,提取粪便细菌DNA,并采用16SrRNAV3区引物(P3GCf、P2r)和V6V8区引物(U968GCf、L1401r)扩增细菌16SrRNA基因可变区,对变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法用于肠道菌群多样性分析的各种条件进行了优化,建立了分析人和动物粪便菌群多样性的DGGE方法。2对引物的粪便DGGE结果都表明,珠磨法和冻融研磨法对细菌的裂解效果优于酶法;P3GCf、P2r引物的条带数明显多于U968GCf、L1401r引物;珠磨法PCRDGGE对普通拟杆菌、青春双歧杆菌和粪肠球菌的检测限分别为(6.4±0.1)×102、(6.1±0.7)×103和(7.2±0.2)×105个细菌,珠磨法对这3种细菌的检测限均低于酶法。结果表明,珠磨法和P3GCf、P2r引物更适宜用于粪便菌群多样性DGGE分析。     

水源性肠球菌对苯扎溴铵及部分抗菌药的耐药性研究

为了解水源性肠球菌对抗菌药和苯扎溴铵的耐药现状,为后期的用药提供新的方向和理论依据。运用肠球菌选择培养基和多重PCR法对福建省部分河流和猪场环境中的水源性肠球菌进行分离和种水平鉴定,采用微量肉汤法测定分离菌株的MIC值,并且用PCR方法检测16种相关抗性基因。结果显示,福建省部分地区水源性肠球菌的分离率为71.43%,其中粪肠球菌占41.33%、屎肠球菌占14.67%;多重耐药率为74.67%,对红霉素的耐药率最高,为81.33%,其次为四环素74.67%,对氨苄西林和万古霉素较敏感,耐药率仅为4.00%和2.67%;有22.67%的分离菌对苯扎溴铵的MIC值高于标准菌;共有9种抗性基因被检出,其中gyrA基因的检出率最高,为93.33%,其次是tetL基因,也高达80.00%。结果表明,福建省部分地区水源性肠球菌分离率较高且多重耐药现象严重,粪肠球菌为优势菌,且耐药率高于屎肠球菌,携带多个抗性基因是导致分离菌株对抗菌药物产生耐药性的主要原因,分离菌整体对苯扎溴铵较敏感,耐受水平低。     

进境动物源性饲料中沙门菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速鉴别诊断进境动物源性饲料中沙门菌的实时荧光定量PCR方法,以inv A基因为靶基因,通过构建p UCm-inv A重组质粒建立的标准曲线确定了检测体系的灵敏度,并利用特异性试验和稳定性试验评价体系的检测性能。结果显示,该检测体系对基因组DNA的检测灵敏度为17 copies/L;由标准曲线的相关系数可知,初始拷贝数的对数值与Ct值之间具有良好的重现性(R2=0.988);进境动物源性饲料样品的检出率与国标法一致;30份模拟污染样品的检出率达100%。结果表明,建立的快速鉴别诊断方法具有检测限低、重复性好、定量准确、数小时内即可得出检测结果的优点,极大地提高了进境动物源性饲料中沙门菌检测的工作效率和口岸通关速度。