抗狂犬病病毒核蛋白单链抗体的表达及活性鉴定

为了获得抗狂犬病病毒(RV)核蛋白(N)的单链抗体,从分泌抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因,利用重叠引物延伸法将轻链可变区基因和重链可变区基因连接,同时引入连接肽编码序列,成功扩增得到单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后得到融合蛋白。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,融合蛋白大小约为32ku,主要以包涵体的形式存在,能被抗His标签的单克隆抗体特异性识别。间接竞争ELISA检测结果表明,该单链抗体能够与RV-His-N重组蛋白和RV结合。抗RV核蛋白单链抗体的成功表达,为单链抗体在狂犬病的诊断和治疗中的进一步研究奠定了基础。     

新的高致病性PRRSV毒株FZ16A的分子特征及其致病性的研究

为了掌握猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分离株的遗传变异特点,从福建省某疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集病料并分离病原,采用RT-PCR、间接免疫荧光试验及基因测序等方法将其鉴定为HP-PRRSV,命名为FZ16A株。对FZ16A株ORF5基因进行克隆和测序,并进行分子生物学研究。将分离毒株接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄仔猪,通过观察临床症状、病理解剖变化及其病理切片等指标初步探讨分离毒株的致病性。结果,FZ16A株是北美(NA)基因型高致病性PRRSV(HP-PRRSV)变异株。同源性分析显示,FZ16A株ORF5基因与北美株VR-2332核苷酸(氨基酸)序列的相似性为87.9%(85.1%),与JXA1的相似性为98.8%(97%),与欧洲典型菌株Lelystad病毒的相似性为63.3%(56.9%)。系统发育分析表明,FZ16A属于NA基因型,与其他高致病性PRRSV毒株具有相同的亚型。氨基酸序列分析表明,与VR-2332株相比,FZ16A在信号肽、跨膜区(TM)、初级中和表位(PNE)、非中性表位和N-糖基化位点方面有不同程度的变异。抗原性分析显示,FZ16A ORF5基因产物与JXA1具有相似的抗原性,抗原表位主要位于aa32-37,aa50-55,aa127-133,aa136-142,aa147-156,aa159-171,aa174-185和aa193-198区域。致病性分析表明,该分离毒株感染猪后能引起体温升高、咳嗽、食欲下降等临床症状,但并未引起试验动物死亡。剖检结果显示,FZ16A分离株能引起试验动物肺部组织实变,淋巴结肿大。肺脏病理切片可见FZ16A感染组动物有明显的间质增生性肺炎,肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡壁增厚等变化。以上结果表明,本研究分离的FZ16A株是新的变异毒株,丰富了该地区的PRRSV基因数据库,并为该地区PRRSV分子流行病学研究及防控奠定了一定基础。