A型动物流感病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用

根据A型流感病毒M基因核苷酸序列设计引物及探针,建立了一种灵敏度高、特异性强、检测迅速、操作简便的重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)。选用常见动物疫病病原验证引物探针的特异性,设计多对引物及探针,筛选出最适反应体系及反应条件,并与实时荧光RT-PCR方法比较。结果显示,本研究建立的RT-RPA方法特异性强,只有A型动物流感病毒呈阳性,其他相关常见病原均为阴性;反应时间短,检测反应时间仅需20 min;灵敏度高,最低可检测到A型动物流感病毒核酸浓度为0.96×10-2g/mL。与实时荧光RT-PCR方法相比,其灵敏度稍低。本研究建立的检测A型动物流感病毒的RT-RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,检测快速,适合现场检测以及在基层实验室推广应用。     

基于CRISPR/Cas12a技术的非洲马瘟病毒可视化检测方法的建立

根据AHSVS7基因的保守序列,设计、合成和筛选出反转录重组聚合酶介导的恒温扩增（RT-RAA）特异性引物和CRISPR/Cas12a特异性crRNA,结合侧向流试纸建立了一种AHSV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法,并对其性能进行了评估。结果显示,该方法与蓝舌病毒（BTV）、鹿流行性出血热病毒（EHDV）、伪狂犬病病毒（PRV）、马传染性贫血病毒（EIAV）、马动脉炎病毒（EAV）、马流感病毒（EIV）的核酸均无交叉反应;敏感性试验结果显示,本方法最低可检出2.16×101copies/μL的AHSV核酸;应用该方法及WOAH推荐的RT-q PCR方法对50份模拟样品进行平行检测,结果显示,Kappa值为0.956,表明两者具有高度一致性。综上表明,本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法特异性好、敏感性高,且操作简单、无需特殊仪器,可应用于野外或口岸现场的AHSV快速筛查检测工作。     

鉴别ASFV野毒株与CD2v缺失株抗体检测方法的建立及应用

本研究通过建立两种不同包被抗原的间接ELISA方法,旨在对ASFV野毒株与CD2v缺失株进行鉴别诊断。通过优化后的EP402R基因序列进行原核表达重组蛋白,纯化后作为包被抗原建立基于CD2v重组蛋白的间接ELISA方法;参考WOAH方法对灭活后的ASFV进行纯化,并作为包被抗原建立基于全病毒蛋白的间接ELISA方法。通过对抗原包被浓度等条件的优化,建立的基于CD2v重组蛋白的间接ELISA方法灵敏性可达1∶1 280,批内变异系数小于4.15%,批间变异系数小于9.48%;建立的基于ASFV全病毒蛋白的间接ELISA方法灵敏性可达1∶2 560,批内变异系数小于3.83%;批间变异系数小于5.04%。这两种方法均不与PRRSV、CSFV、PCV2等常见猪病阳性血清发生反应,特异性强。在96份临床猪血清样本中检出79份阴性血清、12份野毒株感染阳性血清和5份CD2v缺失株感染的阳性血清,与商品化试剂盒符合率分别达到87.5%与97.9%。本试验基于CD2v重组蛋白和ASFV全病毒蛋白建立了两种特异性强、敏感度高的间接ELISA方法,两者结合使用可以从血清学方法上区分ASFV野毒株感染和C...     

A型动物流感病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用注

根据A型流感病毒M基因核苷酸序列设计引物及探针,建立了一种灵敏度高、特异性强、检测迅速、操作简便的重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)。选用常见动物疫病病原验证引物探针的特异性,设计多对引物及探针,筛选出最适反应体系及反应条件,并与实时荧光RT-PCR方法比较。结果显示,本研究建立的RT-RPA方法特异性强,只有A型动物流感病毒呈阳性,其他相关常见病原均为阴性;反应时间短,检测反应所需时间仅20 min;灵敏度高,最低可检测到A型动物流感病毒核酸浓度为0.96×10~(-2)μg/mL。与实时荧光RT-PCR方法相比,其灵敏度稍低。本研究建立的检测A型动物流感病毒的RT-RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,检测快速,适合现场检测以及在基层实验室推广应用。