狂犬病“靶向性”Th表位DNA疫苗的构建与瞬时表达研究

用RT-PCR扩增BALB/c小鼠P31基因,在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变;采用定向克隆方法将狂犬病病毒核蛋白、糖蛋白及NS蛋白主要Th抗原表位核苷酸序列替换P31序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应获得带有Kozak调控序列的P31-Th分子,以增加目的基因的表达量,并将含有Kozak序列的P31-Th分子克隆入真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定;最后将各Th表位表达载体转染COS-7细胞,Western-blot检测目的基因的瞬时表达。测序分析结果表明,BALB/c小鼠P31基因CDS区长648bp,编码215个氨基酸,与Gen-Bank中登录的Ii分子（NM₀10545）的核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异;定点突变后获得了P31分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明,成功构建了携带P31-Th分子的真核表达载体;Western-blot分析证实,各P31-Th分子均在COS-7细胞中获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P31多克隆抗体发生抗原抗体结合反应。结果表明,作者成功构建了狂犬病病毒主要Th抗原表位的"靶向性"核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础。