猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示,猪的卵丘细胞生长形成单层需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10~11 d和8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因载体的构建与表达

为探讨应用转基因动物技术降低奶牛乳腺炎发病的可行性,参照人溶菌酶(human lysozyme,hLZ)基因序列(NM_000239.2)设计引物,采用RT-PCR方法从人胎盘组织中成功扩增克隆了406bp的hLZ基因成熟肽片段。应用娟姗牛酪蛋白乳腺特异表达调控元件,经过多步酶切、连接、转化、筛选、鉴定,构建成奶牛乳腺表达hLZ的载体pBCN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(13.6kb)和pBCN-3.8-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(12.2kb)。将构建的2个载体瞬时转染Bcap细胞,24h后可观察到EGFP的表达;通过实时定量PCR检测比较2个载体hLZ的表达丰度,结果,相对表达量分别为0.89±0.04和0.62±0.05。将线性化的pB-CN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo载体转染Bcap细胞,筛选后获得阳性细胞克隆,纯化阳性细胞总蛋白进行SDS-PAGE分析,与空白对照相比,检测到14ku的新蛋白条带。Western-blot分析中亦出现14ku的特异性条带。证实构建的载体能够正常表达hLZ基因,这为进一步研究获得自然抵抗乳腺炎的转基因奶牛奠定了工作基础。