羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒(CaPV)末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法.结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性.与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性.表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测.     

表达Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株的构建

为构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒(GTPV)弱毒株,将Asia 1型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、痘苗病毒启动子(p7.5)相连,构建成一整体基因表达盒p7.5-EGFP-P12A3C.以GTPV胸苷激酶基因序列中的Kpn Ⅰ酶切位点为插入位点.将整体基因表达盒插入转移载体骨架pUC119-TK中,构建GTPV转移载体pTK-p7.5-EGFP-P12A3C.将转移载体转染GTPV弱毒株AV 41感染的BHK-21细胞,转染后24 h就可见到绿色荧光,表明,成功获得了能表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV.     

山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA复制非必需区的筛选

提取山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA,用HindⅢ酶切,随机克隆到pUC18质粒中,限制性内切酶片段电泳分析和序列测定结果表明,克隆到4个不同大小的HindⅢ片段pUA、pUB、pUC和pUD。随后,将它们和羊痘病毒Pellor(AY077835)株进行了同源性比较,发现核苷酸同源性为90.0%~94.5%,氨基酸同源性为83.0%~91.4%。选取克隆或亚克隆后的单一酶切位点,插入P11P7.5-LacZ报告基因,构建了pUA1、pUB1、pUC1和pUD1共4个重组载体质粒。通过脂质体分别转染山羊痘病毒感染的BHK-21细胞,在X-gal存在条件下经蓝白斑筛选重组病毒,获得1株重组病毒,证明筛选出了1个复制非必需区片段。     

山羊痘弱毒疫苗株TK基因的克隆及序列分析

以提取的山羊痘弱毒疫苗株HLJ-V9 DNA为模板,设计特异性引物并进行PCR扩增,获得了2078 bp的DNA片段,并将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体。酶切鉴定、PCR鉴定和测序结果表明,成功获得了TK基因,获得的TK基因内存在一个KpnⅠ酶切位点和编码区的早期转录终止信号TTTTTN(T)T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明,弱毒疫苗毒株HLJ-V9 TK基因与参考毒株的同源性在95.5%~100%之间,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。