大熊猫源停乳链球菌类马亚种的分离与鉴定

为研究引起大熊猫脚掌化脓感染的原因,有效防治该病,对大熊猫感染部位的浓汁进行了细菌学检查及分离,对分离菌进行形态特征、理化特性鉴定、兰氏分群以及16S rDNA序列的分子鉴定,并构建系统发育树;对分离菌进行健康小鼠的人工感染试验。结果分离到5株细菌,根据5株分离菌的形态特征、理化特性及兰氏分群结果,结合16S rDNA序列测定与系统发育分析结果,判定为链球菌属的停乳链球菌类马亚种。该分离菌对供试健康小鼠有较强的致病作用。证实分离菌即为引起大熊猫脚掌化脓感染的病原菌。     

大熊猫轮状病毒CH-1株外衣壳蛋白VP4基因的克隆与生物信息学分析

利用MA-104细胞培养增殖大熊猫轮状病毒CH-1株,提取总RNA,运用RT-PCR扩增外衣壳蛋白VP4基因,将其与pMD19-T simple vector连接并转化DH5α,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得大熊猫轮状病毒VP4蛋白基因,长2 362bp,包含一个2 331bp的开放阅读框,编码776个氨基酸,测序结果在GenBank中的登录号为HQ641296。生物信息学分析表明,VP4蛋白基因编码产物分子质量为86 768.8u,理论等电点为5.56,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为28.64,脂肪指数为82.53,总平均亲水性为-0.265,最大疏水性为2.244,最小疏水性为-2.911;无信号肽序列;跨膜结构分析显示VP4蛋白无跨膜区,位于病毒膜外区;在VP4序列中的抗原决定簇主要位于VP4的N-末端和C-末端。预测其可能包含8个N-糖基化作用位点,15个蛋白激酶C磷酸化作用位点、15个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、12个N-豆蔻酰化位点。系统进化分析显示,大熊猫轮状病毒的VP4基因与猪轮状病毒的VP4基因的进化距离最...     

中国大鲵维氏气单胞菌病的组织病理学观察

运用病理切片和HE染色技术,对维氏气单胞菌自然感染大鲵的肌肉、肝、肾、肺、肠道等器官的组织病理学变化进行了观察。结果显示,肝可见大量淋巴细胞和少量中性粒细胞,肝细胞空泡状变性,肝血窦内见大量血细胞;肾集合管中可见少量蛋白样物,血管球扩张,有的溶解坏死;心肌纤维溶解,甚至坏死,可见充血和出血;胰细胞颗粒变性;肺偶见充血;脾索排列紊乱,脾窦中充满大量红细胞和巨噬细胞;肠道内肠绒毛溶解脱落,有充血现象;肌纤维蜡样坏死,肌细胞核浓缩凝固,深染,破碎。证实,维氏气单胞菌能使中国大鲵的多个组织器官出现严重的病理变化而导致死亡。     

大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因的克隆和生物信息学分析

为研究大熊猫源轮状病毒(RV)CH-1株外衣壳蛋白VP1基因的结构及功能,采用MA-104细胞增殖大熊猫源RV,提取总RNA,运用RT-PCR扩增VP1基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得了长3 287bp的GPRV VP1蛋白基因(GenBank登录号:HQ641297);经生物信息学分析,此序列包含有一个3 267bp的完整开放阅读框,编码1 089个氨基酸;无信号肽;无跨膜区,其整个蛋白都位于病毒膜外区;抗原表位预测显示VP1蛋白有41个抗原表位;系统进化树分析显示大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因与猪A组轮状病毒VP1基因的进化距离最近。本研究成功获得了大熊猫源RV VP1基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。     

山羊鼻内肿瘤病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的山羊鼻内肿瘤病毒(ENTV)SC株的基因序列,设计合成了1对特异性引物,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测ENTV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RTPCR扩增,能得到与理论设计值大小相符的323bp的特异性条带;与ENTV-SC株相应序列的同源性达98%;该方法最低可检测出6pg的ENTV;用此方法对健康山羊鼻黏膜上皮、健康牛鼻黏膜上皮、绵羊肺腺瘤病毒、肺炎球菌和大肠杆菌的扩增结果均为阴性,重复性和稳定性好;对随机收集的100份山羊样品进行检测,并与临床诊断结果进行比较,符合率为100%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性均好,可用于山羊鼻内肿瘤病毒的临床检测和试验研究。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

大熊猫轮状病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的大熊猫轮状病毒(RV)VP7基因序列,设计了1对特异性引物,建立了快速检测大熊猫RV的RT-PCR方法.用该方法对MA-104细胞增殖的大熊猫RV进行RT-PCR扩增,结果得到与试验设计相符的342 bp的特异性扩增条带,而对传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增结果为阴性.测序比对结果证实该体系检测结果准确;该方法最低可检测出约1 pg的病毒核酸;重复性试验结果显示,其检测重复性好,提示该RT-PCR方法可用于大熊猫RV的临床快速检测.     

伪狂犬病病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞的增殖特性

体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,用伪狂犬病病毒感染骨髓间充质干细胞,通过细胞病变观察、毒力测定、PCR及间接免疫荧光试验,评估了伪狂犬病病毒在间充质干细胞内的增殖情况。结果显示,经体外分离培养并鉴定的间充质干细胞感染伪狂犬病病毒后,产生典型的细胞病变;经毒力测定细胞内伪狂犬病病毒的TCID50效价较高;经PCR从间充质干细胞内成功扩增出伪狂犬病病毒的特异性片段;间接免疫荧光试验显示间充质干细胞内分布有特异性荧光。表明,该细胞适应伪狂犬病病毒在其上增殖繁衍,具有作为伪狂犬病病毒致细胞病变机理、潜伏感染及致病等机制平台的潜质。     

高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株.以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价.结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×109～3.15×100copies/uL具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.998;最低检测限为3.15 copies/uL.对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%.表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV-SC株基因组cDNA文库的构建及生物信息学分析

根据山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)基因组序列设计5对引物,通过RT-PCR技术从山羊地方性鼻内肿瘤自然感染病例的鼻液中分段扩增获得了ENTV的基因组,构建了ENTV的cDNA文库,并对基因组序列进行了生物信息学分析.结果显示,获得的序列全长7 168 bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及部...