应用Amp-RFLP和SSCP技术分析DNaseⅠ基因的C1978G基因座多态性

为研究人类DNaseⅠ基因点突变C1978G多态性,应用Amp－RFLP和SSCP技术对DNaseⅠ基因C1978G基因座分型,调查173例汉族无关个体,获DNaseⅠ*1978C和*1978G基因频率,即分别为0．5058和0．4942。其基因型频率分布与Hardy-Weinberg平衡吻合,基因座杂合度0．5028,Dp值0．6040,PE值0．1875。经对Iida等介绍的方法作了改良,分型结果稳定可靠,电泳分离时间由18h减至6h。研究证实,DNaseⅠ基因C1978G点突变是一个高多态性基因座,可应用于法医材料的分型调查。     

贵阳地区常见尸食性蝇类mtDNA分子标记的检测

目的应用mt DNA中COI(348bp)、COII(637bp)及16Sr DNA(513bp)基因序列鉴定贵阳地区常见尸食性蝇类的种属。方法收集贵阳地区常见尸食性蝇类标本,经形态学分类鉴定后提取胸肌DNA,扩增COI(348bp)、COII(637bp)及16Sr DNA(513bp)基因片段,测序后用DNAMAN 4.0序列分析软件进行序列拼接,NCBI中的BLAST、MEGA 5.2软件包对所得序列分析建立种内及种间进化分歧率,并构建系统发育树。结果 COI种间平均进化分歧率为12.55%,种间范围在3.0%~18.6%,种内范围在0%~0.7%;COII种间平均进化分歧率为13.73%,种间范围在5.3%~21.6%,种内范围在0%~0.6%;16Sr DNA种间平均进化分歧率为4.54%,种间范围在0.4%~7.6%,种内范围在0%~0.4%。结论 COI、COII及16Sr DNA可用于尸食性蝇类的种属鉴定,该方法可作为传统分类方法的补充手段。     

基于抗原蛋白Fiber-2及细胞因子佐剂的Ⅰ群4型禽腺病毒亚单位疫苗的开发

为了开发一种抗I群4型禽腺病毒(FAd V-4)的亚单位疫苗,选择I群禽腺病毒血清4型流行毒株衣壳蛋白Fiber-2作为保护性抗原蛋白。利用昆虫细胞-杆状病毒系统生产Fiber-2蛋白,通过Westernblot检测重组蛋白的表达情况,利用双向琼脂扩散法检测重组Fiber-2的免疫原性。为了增强亚单位疫苗的免疫保护效果,添加鸡源白细胞介素2(chIL-2)和鸡源γ-干扰素(ch IFN-γ)作为免疫佐剂,与重组Fiber-2单独或混合使用,制备多种形式的亚单位疫苗,并进行动物攻毒保护试验。重组蛋白的Western-blot鉴定结果显示,63 ku处出现Fiber-2蛋白目的条带;双向琼脂扩散试验结果显示,重组蛋白效价达到1∶128,表现出良好的反应原性。动物攻毒保护试验结果显示,单独使用Fiber-2免疫SPF鸡,在50 μg/只的剂量下,可为SPF鸡提供100%的保护效果,以chIL-2和chIFN-γ为免疫佐剂,与重组Fiber-2联合免疫SPF鸡,可显著增强Fiber-2在低剂量(10 μg/只)下的免疫保护效果,上述结果表明重组Fiber-2联合chIL-2和chIFN-γ细胞因子佐剂所制备的亚单位疫苗在抗I群4型禽腺病毒感染领域具有良好的应用前景。     

Ⅰa型和Ⅱ型牛源无乳链球菌sip基因的遗传进化分析

为分析8株Ⅰa型和10株Ⅱ型牛源无乳链球菌的sip基因特征和遗传进化关系,采用PCR方法扩增目的基因并克隆入pGEM-T Easy载体后测序,进行了同源性分析和构建了遗传进化树。结果显示,18株菌株的sip基因全长均为1 305bp,无基因缺失。8株Ⅰa型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为99.8%～100%和99.5%～100%;而10株Ⅱ型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性均为100%。18株菌株与其他不同来源、不同血清型参考菌株相应序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为97.8%～100%和96.8%～99.8%。sip基因的遗传进化树分析显示18株菌株处于2个不同的大分支上,其中Ⅱ型菌株处于同一分支上,与中国菌株Mf32和美国菌株GB01068、GB01089的亲缘关系最近,而Ⅰa型菌株处于另一个分支上,与中国菌株Ly2和美国菌株GB00549的亲缘关系最近。说明8株Ⅰa型菌株和10株Ⅱ型菌株分别来源于不同的菌株,但它们的sip基因同源性很高,而且与参考菌株的sip基因相比,目前仍属于保守基因。     

Ⅰ群禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

为建立一种检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)抗体的间接ELISA方法,以FAVⅠhexon重组蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立了FAVⅠ抗体间接hexon-ELISA检测方法。抗原最佳包被浓度为10.0μg/mL,最适包被条件为37℃2h加4℃过夜;最佳封闭液为50g/L脱脂乳;血清最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为75min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 000,最佳作用时间为45min;hexon-ELISA阴性、阳性临界值为0.379。用建立的hexon-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为45%。结果表明,建立的hexon-ELISA方法简便、快捷,可大批量检测,具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于FAVⅠ的诊断、抗体水平监测及流行病学调查。     

早期心肌缺血猝死心肌Ⅰ型胶原的表达

目的探讨Ⅰ型胶原蛋白在心肌早期缺血死后诊断中的法医学价值。方法将收集的案例心肌蜡块分为3组：正常对照组、早期心肌缺血组、心肌梗死组,用免疫组织化学技术（S-P法）,观察猝死心肌内Ⅰ型胶原的表达情况,对其结果进行半定量分析。结果早期心肌缺血组和心肌梗死组心肌细胞质以及细胞核染色阳性,且早期心肌缺血组与心肌梗死组表达强度相近,说明早期心肌缺血组在胶原网结构方面已经发生与心肌梗死相同的改变。结论Ⅰ型胶原可以作为早期心肌缺血的一个诊断指标。     

提取CO Ⅰ基因片段鉴定嗜尸性蝇类

目的通过扩增蝇类COⅠ基因片段,结合形态学特征鉴定嗜尸性蝇类的种类。方法运用改良平衡酚—tris饱和酚法提取蝇类DNA,进行COⅠ序列扩增和测序,与数据库序列进行比对和分析。结果改良平衡酚—tris饱和酚提取DNA方法可获得有效的蝇类DNA,并可应用于COⅠ基因片段扩增,进而进行蝇类种类的鉴定。结论平衡酚—Tris饱和酚法提取的噬尸性蝇类虫体DNA作为模板,用于COⅠ序列扩增,测序后与数据库目的序列分析比对,可准确鉴定嗜尸性蝇类的种类;和传统的昆虫形态学特征鉴定方法比较,该体系更准确,应用范围更广。     

骨骼肌肌钙蛋白I的研究进展及法医学应用展望

骨骼肌肌钙蛋白I(skeletal troponin I)是骨骼肌特有的蛋白质,在骨骼肌收缩过程中起主要调节作用。当骨骼肌细胞受损时,其快速释放进入血液循环,血液中骨骼肌肌钙蛋白I的浓度发生变化,测定其浓度有望成为检测骨骼肌损伤的新方法。该指标敏感性高、特异性强的诊断意义日益凸显。同时,骨骼肌肌钙蛋白I在法医学损伤时间推断方面可能有良好的应用前景。     

大鼠骨关节炎模型病变程度与血清CTX-Ⅰ、PINP、OC骨代谢标志物的相关性研究

为探讨在大鼠骨关节炎模型中,骨代谢标志物CTX-Ⅰ、PINP、OC浓度变化与骨关节炎发病程度的相关性,本试验选用60只雄性SD大鼠,随机分为对照组(n=30)和模型组(n=30)。模型组经前十字韧带切断(ACLT)手术法诱导骨关节炎,对照组进行假手术,分别于第0、3、6、9、12和15周取血清和胫骨样本。采用ELISA法检测CTX-Ⅰ、PINP和OC浓度,胫骨平台进行宏观观察和组织学检测,并对组织学变化采用OARSI评分,分析骨代谢标志物浓度变化与骨关节炎病变程度的相关性。结果显示,与对照组相比,第15周时模型组CTX-Ⅰ和OC的浓度显著增加(P<0.05),OARSI评分显著增加(P<0.05),且CTX-Ⅰ和OC的浓度分别与OARSI评分呈正相关(r=0.811 1和r=0.761 4,P<0.01)。结果表明,CTX-Ⅰ和OC可能是早期诊断骨关节炎的潜在指标,为深入研究骨关节炎发病机制提供了资料。     

猪流行性腹泻病毒SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)株的ORF3基因序列保守型片段设计特异性引物,建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。在4.32×102～4.22×107copies范围内,它有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异峰,无引物二聚体,熔解温度为82.23℃±0.19℃。它对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,表明其特异性强。该方法的组内变异系数为0.05%～0.87%,组间变异系数为0.32%～1.24%,重复性好。结果表明,建立的SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR为PEDV早期感染的诊断及定量分析提供了新的方法。