微小牛蜱Bm86基因的真核表达

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68 ku重组Bm86蛋白,目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32%以上,诱导96 h目的蛋白的表达量为0.36 mg/mL。     

Asia 1 型口蹄疫病毒多表位基因的设计及其在毕赤酵母中的表达

为制备Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)特异性诊断抗原,根据国内Asia 1型FMDV流行毒株的序列,合成了2个FMDV流行毒株VPl基因的5个抗原表位.采用Insight Ⅱ软件进行蛋白空间构象模拟,证实设计的多表位分子结构符合要求.将合成的多表位基因按设计的酶切位点进行酶切连接,构建了Asia 1型FMDV VP1双拷贝基因重组质粒(pMD18-dVP1Asia).从该重组质粒获得dVP1Asia基因,与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了重组表达质粒pPIC9K-dVP1Asia.用BglⅡ将重组表达质粒线性化后,转化GS115酵母菌.经筛选、鉴定,成功获得了表达FMDV多表位VP1蛋白的阳性重组酵母茵.该阳性重组酵母茵经甲醇诱导,在培养液上清中可检测到目的蛋白.Western-blot结果显示,该蛋白能特异识别Asia 1型FMDV抗体,且具有很好的反应原性.     

微小牛蜱Bm91基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

从我国半饱血微小牛蜱雌性成蜱肠道和唾液腺中提取总RNA;参照GenBank中已发表的微小牛蜱Bin91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物.采用RT-PCR技术扩增Bm91基因,测序正确后将其亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoR I酶切位点,构建重组表达载体pPIC9K-Bm91.再次测序正确后将其用Sac Ⅰ内切酶线性化,电转化毕赤酵母GS115并经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,Bm91基因获得了成功表达,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的83 ku的重组Bm91蛋白.     

猪带绦虫TSO18基因真核表达载体的构建及其表达

采用PCR从重组克隆载体pGEMTSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接,构建重组表达载体pPIC9kTSO18,转化大肠埃希氏菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9kTSO18,用SalⅠ线性化,并电转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株,以甲醇进行诱导表达,SDSPAGE和Westernblotting分析结果表明,诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白,目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80%以上,诱导72h目的蛋白表达量为0.5mg/mL。     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,利用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析,表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17 ku大小的分泌性目的蛋白,采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化,纯化结果理想。     

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His Mut 表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。     

鸡PrP基因真核表达载体的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达

为构建鸡PrP基因的真核表达载体,并通过毕赤酵母表达系统获得鸡朊蛋白(ChPrP),根据毕赤酵母GS115的密码子偏好性、G+C含量等特点对目的基因PrP(25~248)进行密码子优化与基因合成,同时以特异性引物扩增获得天然未经密码子优化的目的片段,之后将两种目的片段分别连接于pPIC9K表达载体并转化至毕赤酵母GS115中,经PCR,选择培养基MM、MD方法鉴定表型后以甲醇进行诱导获得目的蛋白,最后以SDS-PAGE检测蛋白表达。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,成功构建了真核表达重组载体pPIC9K-PrP(25~248),并在毕赤酵母GS115中获得鸡朊蛋白,其与未经密码子优化的目的蛋白相比,具有更高的表达量。本研究通过毕赤酵母表达系统成功获得了鸡朊蛋白,为后续研究奠定了基础,也通过密码子优化前后蛋白表达量比对,再一次证实毕赤酵母具有较高的密码子偏好性。     

家蝇幼虫溶菌酶1基因的克隆与真核表达及表达产物抑菌活性的检测

采用PCR扩增获得家蝇溶菌酶1基因(Musca domesticalysozyme-1,MdL-Ⅰ),构建真核重组表达质粒pPIC9K-MdL-Ⅰ。将线性化的重组质粒电击转入巴斯德毕赤酵母感受态GS115细胞内。将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-Tris-SDS-PGAE检测表达产物的大小;经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MdL-Ⅰ获得高效表达,蛋白质的分子质量为14.2ku,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌、雏沙门菌均具有体外抑菌活性。本研究为利用毕赤酵母表达系统规模化生产具有抑菌活性的MdL-Ⅰ蛋白奠定了基础。     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum)成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因(TPI),鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接,构建重组表达质粒pPIC9k-TPI,并将其电击转化到毕赤酵母GS115中,重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白,经SDS-PAGE、western-blotting检测,并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示,成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43 ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

新城疫病毒HN基因在毕赤酵母中的表达及其表达产物的免疫原性

应用RT-PCR获得新城疫病毒(NDV)La Sota株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因片段,将HN基因片段定向插入毕赤酵母表达载体pPICZaA,构建了分泌型表达载体pPICZaA-HN,将其用Sac I线性化后电转化入P.pastoris X-33.经高抗性及阳性转化子筛选得到重组菌株X-33/pPICZaA-HN,甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE、Western-blot和血凝活性检测,结果约在97 ku处有目的条带.比预期分子质量大,占总蛋白的53%,与NDV阳性血清发生特异性免疫反应,并具有较高的血凝活性.表明,HN基因在毕赤酵母中成功地进行了表达且表达产物具有良好的免疫原性.     

传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点,经过酶切、测序分析,筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒,分别命名为pCAGGgB、pCAGGgC、pCAGGgD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化,将纯化后的质粒转染293T细胞,用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明,目的蛋白得到了真实的表达。     

新城疫病毒F48E9株M NP F和HN基因的真核表达

将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。     

两株家鸭禽流感病毒H3N1亚型分离株的致病性及其表面糖蛋白基因序列分析

测定了2株禽流感病毒(AIV)Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性；对其血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列进行了测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果,此2株AIV对SPF鸡具有较低的致病性,而对BALB/c小鼠无致病性；Dk/YZ/231/02株的HA基因与Dk/Ukraine/1/63(H3N8)株的同源率最高,Dk/YZ/3/ 04株的HA基因与Petbird/HK/1559/99(H3N8)株的同源率最高；而Dk/YZ/231/02株的NA基因与Dk/Fujian/17/2001(H5N1)株的同源率最高,Dk/YZ/3/04株的NA基因与Gs/Guangdong/ 1/96(H5N1)株的同源率最高。进化分析结果表明,Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04株的NA基因均可能起源于水禽源H5N1亚型AIV,这可能是不同亚型AIV在水禽体内基因重组的结果。推导的氨基酸剪切位点序列均为PEKQTR,属于非高致病性AIV的特征序列。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

鸡传染性支气管炎病毒HN株5a 5b及N基因的遗传变异分析

从河南省某鸡场中疑似鸡传染性支气管炎(IB)的雏鸡病料中分离到1 株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),暂命名为HN,鉴定为IBV。从接种HN毒株的鸡胚尿囊液中提取单股RNA后应用反转录聚合酶链反应(RT PCR)技术扩增得到包含IBV HN株5a、5b蛋白及N蛋白基因的约1 600 bp片段;将克隆测序的5a、5b及N基因分别与GenBank中11 株国内外参考毒株相应基因进行序列比较与遗传变异分析,发现IBV HN株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。     

猪PD-1分子及其配体的实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪程序性死亡因子PD-I及其配体PD-LI和PD-L2的基因序列,分别设计了特异性引物和TaqMan探针,以10倍系列稀释的重组质粒pMD-PD-1、pMD-PD-L1和pMD-PD-L2为标准品,对实时荧光定量PCR的条件进行优化,以建立定量检测这3个基因的方法.结果表明,建立的方法在1×10~2～1×10~8copies/μL模板范围内具有良好的线性关系(r~2>0.99),扩增效率均高于96%,可检测至少100 copies的阳性标准品.利用该方法对猪外周血单核细胞中这3个基因的表达情况进行了检测,结果也表明该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可应用于临床样品的检测.     

2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析

为掌握广西猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻样品,应用RT-PCR方法进行检测,并随机选取部分PEDV阳性样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果显示,共获得PEDV S基因序列23株、M基因和N基因序列各25株。同源性分析显示,广西流行毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因为90.6%~100%和89.6%~100%,在M基因为97.0%~100%和96.9%~100%,在N基因为95.9%~100%和95.9%~100%。序列比对显示,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、突变和插入现象,且各毒株之间存在差异。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株主要分布在S基因的GⅠb、GⅡa亚群,M基因的GⅡa、GⅡb亚群,N基因的GⅢ亚群。遗传进化速率测算显示,广西流行毒株及国内外参考毒株S、M、N基因的平均进化速率分别为7.39×10-4、1.43×10-4和2.96×10-4substitutions/site/year,S基因的变异速度最快。表明PEDV广西流行毒株存在遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

乳牛前脂肪细胞原代培养过程中ADPN基因和HSL基因表达水平的检测

选取犊牛大网膜脂肪组织,进行牛前脂肪细胞的单层贴壁培养,在细胞接种后第4、6、8、10、12、141、6 d分别提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法,检测了体外培养的犊牛前脂肪细胞不同时期ADPN基因mRNA和HSL基因mRNA的表达情况。结果表明,单层培养的脂肪细胞在第4、6、8、10、12、141、6 d,ADPN基因mRNA的表达水平呈先下降后升高的趋势,而HSL基因mRNA的表达水平则呈下降趋势。     

肾型传染性支气管炎病毒的鉴定和结构蛋白的表达

对分离自江苏省某发病蛋鸡群中1株病毒(Ck/Jiangsu/DS10/2008,DS10)进行了生物学特性鉴定。同时利用RT-PCR扩增该病毒的S基因、M基因和E基因并进行测序,与GenBank中其他参考株构建进化树,进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因、M基因和E基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9细胞进行表达,用间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。经生物学特性鉴定,DS10病毒为嗜肾型传染性支气管炎病毒(IBV)。遗传进化分析表明,各基因之间的遗传进化关系无明显相关性。间接免疫荧光检测表明,S蛋白、M蛋白和E蛋白在Sf9细胞中得到表达。琼扩试验证实,S基因和M基因的表达产物具有良好的反应性,而E蛋白未发现与阳性血清反应所产生的特异沉淀线,表明所表达的S蛋白和M蛋白具有良好的生物学活性,E蛋白可能因其自身分子质量小,在病毒中的含量较少相关。研究结果提示,现有传染性支气管炎疫苗对流行株保护效果不佳,表达的S蛋白、M