鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为研究sifA基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的sifA基因缺失株S06004ΔsifA,同时构建该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA),并对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性进行了研究。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了sifA基因缺失株S06004ΔsifA和该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA);生物学特性研究结果显示,sifA基因的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其对3日龄雏鸡的LD50升高了39.3倍。本研究获得的减毒鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株S06004ΔsifA为进一步研究鸡白痢沙门菌sifA基因的功能奠定了基础。     

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC突变株的构建与鉴定

为了研究spiC基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用同源重组方法构建该基因缺失株。以鸡白痢沙门菌S06004基因组DNA为模板,PCR扩增spiC基因上、下游DNA片段作为等位基因;将上游片段、卡那霉素抗性基因(KmR)及下游片段依次连接并克隆到pGMB151自杀性质粒上,构建重组自杀质粒pGMB151-ΔspiC/KmR,通过大肠杆菌χ7213与鸡白痢沙门菌S06004固相杂交,将质粒转入S06004中,运用反向筛选法获得含KmR基因的spiC基因缺失株(ΔspiC/KmR);再使用编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20敲除KmR,获得无抗性ΔspiC。PCR鉴定和测序结果显示,spiC基因被成功缺失。血清型、生化特性、生长特性、耐药性等鉴定表明,S06004ΔspiC未发生理化特性改变。本研究成功构建了spiC基因缺失株S06004ΔspiC,为进一步研究鸡白痢沙门菌致病性变化及spiC基因的功能奠定了重要基础。     

不依赖RpoS的鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因鉴定

为鉴定鸡白痢沙门菌生物被膜形成不依赖Rpo S的调控基因,以鸡白痢沙门菌S6702及其rpoS基因缺失株S6702ΔrpoS为母本,对S6702生物被膜状态和S6702ΔrpoS生物被膜状态（S7BF vs S7SBF）及S6702ΔrpoS浮游状态和S6702ΔrpoS生物被膜状态（S7SFY vs S7SBF）进行转录组测序分析,筛选差异表达基因,构建基因缺失株并验证其生物被膜形成能力。结果显示,S7BF vs S7SBF组共鉴定出83个差异表达基因,S7SFY vs S7SBF组共鉴定出1 984个差异表达基因,筛选出15个可能与生物被膜形成相关的基因。以STM2361和STM1703为靶标构建基因缺失株,结晶紫染色定量结果显示,STM2361不影响鸡白痢沙门菌生物被膜的形成,而STM1703缺失能增强鸡白痢沙门菌的生物被膜形成能力。本研究鉴定出不依赖RpoS的鸡白痢沙门菌生物被膜形成调控基因,丰富了鸡白痢沙门菌生物被膜调控的信息。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析。结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为3类:噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列。这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素I、paJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因。结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株基因组间存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础。     

鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp的构建及鉴定

为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒株,首先利用自杀质粒介导的同源重组技术构建鸡伤寒沙门菌1009株的spic基因缺失株1009Δspic,在此基础上,运用λ噬菌体同源重组系统进一步敲除crp基因,以构建鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建出双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。生物学特性研究结果显示,1009株spic和crp基因的缺失能够得到稳定的遗传,部分生化特性发生了变化,生长速度较缓慢,对雏鸡的LD50升高了107倍。本研究获得的高度安全的鸡伤寒沙门菌减毒株为进一步研制鸡伤寒沙门菌减毒疫苗奠定了基础。     

大肠埃希氏菌和沙门菌氨基糖苷耐药基因PCR检测方法的建立

采用平板稀释法,选用氨基糖苷类药物链霉素、庆大霉素、卡那霉素和新霉素对22 株猪、鸡大肠埃希氏菌和30株猪、鸡沙门菌进行了药敏试验。结果显示,在4种药物中大肠埃希氏菌对卡那霉素的耐药率最高,达81.8%,而沙门菌则对链霉素的耐药率最高,达60%,两类细菌都对新霉素的耐药率最低。设计了5对引物,对耐药基因aph(3′) Ⅱ、aadA1、aadA2、aadB和aac(3) Ⅰa进行了扩增,获得的基因片段与预期的大小一致;序列分析表明,扩增产物与GenBank中的相应序列有很高的同源性(>99.8%)。采用建立的PCR技术,对22株猪、鸡大肠埃希氏菌和30 株猪、鸡沙门菌的耐药基因进行了检测,证实耐药基因普遍存在,在大肠埃希氏菌中aadA1 基因的检出率最高(12/22),在沙门菌中aph(3′) Ⅱ基因的检出率最高(18/30),在所有的菌株中都未能检测出aac(3) Ⅰa基因。     

肠炎沙门菌sipA基因缺失株C50336ΔsipA的构建及鉴定

为研究sipA基因对肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)的生物学特性的影响,利用λ-Red同源重组系统构建肠炎沙门菌C50336的sipA基因缺失株,同时将sipA基因克隆至pBR322质粒,将回补质粒电转化至缺失株,成功构建了回补株。通过比较肠炎沙门菌野生株、缺失株以及回补株在生长特性、生化特性、遗传稳定性、对小鼠的半数致死量以及对Caco-2细胞的黏附侵袭能力的差异,发现肠炎沙门菌sipA基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与野生株及回补株相比,其生长特性和生化特性未发生明显改变,对8周龄小鼠的毒力没有显著变化,不影响细菌对Caco-2细胞的黏附能力,但对Caco-2细胞的侵袭能力明显下降。上述研究结果为进一步研究sipA基因在肠炎沙门菌感染过程中的功能奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌yibT基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了探讨yibT基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响,采用λ-red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌CVCC541的yibT基因缺失株CVCC541ΔyibT,同时利用表达质粒pET28a构建yibT缺失株的基因回补株CVCC541ΔyibT/pyibT,研究野生株、缺失株、回补株之间的生长特性、生化特性、遗传稳定性、生物膜形成和应激环境抵抗力等生物学特性。结果表明,本研究成功构建了yibT基因缺失株CVCC541ΔyibT及其回补株CVCC541ΔyibT/pyibT,yibT基因的缺失不影响细菌的生化特性,该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其生长特性较野生株及其回补株显著减缓,生物膜形成能力相较于野生株及其回补株有所减弱,缺失株在热应激环境以及正丁醇压力下表现出更强的耐受力。综上所述,yibT基因的缺失会影响鼠伤寒沙门菌的生长特性、生物膜形成、应激环境抵抗力和细菌形态等生物学特性,并且yibT基因可能影响鼠伤寒沙门菌菌膜的流动性。     

表达IBDV VP2蛋白的重组弱毒肠炎沙门菌的构建及其免疫原性的初步研究

为研究肠炎沙门菌rfaH基因与致病性的关系及肠炎沙门菌rfaH基因缺失株作为疫苗载体的可行性,进一步探索传染性法氏囊病(IBD)的防控路径,通过λ-Red同源重组的方法构建了缺失rfaH基因的肠炎沙门菌(rSD),再以其为亲本菌株构建了稳定表达IBDV VP2蛋白的重组肠炎沙门菌(Se-VP2)。以1日龄SPF雏鸡为实验动物,分别检测了重组菌的致病力及免疫效果。结果显示,rSD株和Se-VP2株与野生株生长速度一致,体外连续传20代,基因缺失株和重组株均可稳定遗传;Western-blot表明,Se-VP2株可稳定表达VP2蛋白;构建的重组菌rSD株和Se-VP2株对SPF雏鸡无致病性,半数致死量(LD50)大于1.0×1010CFU,且重组菌Se-VP2株免疫动物后可同时诱导产生针对IBDV和沙门菌的抗体;重组菌Se-VP2株可以诱导T淋巴细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4,并能刺激外周血淋巴细胞的增殖分化;攻毒保护性试验结果显示,Se-VP2株免疫动物后可对IBDV和沙门菌的感染提供100%的保护。结果表明,rfaH基因是沙门菌的毒力基因,重组弱毒肠炎沙门菌Se-VP2株作为疫苗候选株,对SPF雏鸡安全有效,为后续肠炎沙门菌作为表达载体的研究奠定了基础。     

鸡源唾液乳杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为筛选出对禽沙门菌具有显著拮抗效应的益生菌,从健康肉鸡消化道分离菌株,经细菌形态观察、生化试验鉴定及16S rDNA基因序列分析,共鉴定出14株唾液乳杆菌。体外琼脂扩散试验结果显示,WLS001、WLS002、WLS003、WLS004这4株分离株分别对鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌具有明显抑制作用。pH及胆盐耐受性试验结果表明,WLS001耐受性最强,在pH为2.0、胆盐浓度0.2%条件下均能生存。药敏结果显示,4株菌均对万古霉素耐药。安全性试验表明,所有唾液乳杆菌均没有溶血环,试验组雏鸡体重较对照组增重显著(P0.05)。组织病理切片显示,脾、肝、盲肠及十二指肠形态均正常。结果表明,4株鸡源唾液乳杆菌具有良好的生物学特性和安全性,具备进一步开发微生态制剂的潜力。     

部分省市鸡白痢和鸡伤寒的单抗阻断ELISA血清学调查

采用单抗阻断ELISA法对我国部分省市不同品种、不同类型的鸡群进行了鸡白痢、鸡伤寒的血清流行病学调查。结果,在2309份鸡血清样品中检出阳性359份,阳性率为15.5%,不同鸡场鸡群感染率悬殊较大,从0到54.5%不等。表明,我国鸡群中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌的流行呈现多样化。     

肠炎沙门菌sopE2基因缺失株的构建及其生物学活性的鉴定

为研究sopE 2基因对肠炎沙门菌(Salm onella enteritidis)的生物学特性的影响及其与sopE功能差异,本研究以λ-Red介导的同源重组法构建了肠炎沙门菌C50336ΔsopE 2缺失株,并构建了以p BR322质粒介导的sopE2基因回复株。测定了肠炎沙门菌野生株、sopE 2缺失株及其回复株的基本生物学特性,包括对人肠上皮细胞Caco-2 BBE及小鼠巨噬细胞RAW 264.7的黏附、侵袭能力及对小鼠的半数致死量。结果显示,肠炎沙门菌sopE 2基因缺失对其生长、生化特性无影响;肠炎沙门菌C50336对Caco-2 BBE细胞的黏附率约为20%,侵袭率约为10%,对RAW264.7细胞的黏附率约为55%,侵袭率约为20%,sopE 2基因缺失对肠炎沙门菌C50336黏附能力无影响,侵袭能力有所下降,但无统计学差异;肠炎沙门菌C50336对小鼠的半数致死量为5.0×105CF U,sopE 2基因缺失株及回复株对小鼠的半数致死量均为3.2×105 CFU,表明sopE 2基因缺失对肠炎沙门菌的毒力无显著影响。本研究为进一步探讨sopE 2基因在肠炎沙门菌感染过程中的功能奠定了基础。     

密度感应系统luxS基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性及毒力的影响

通过构建鼠伤寒沙门菌luxS缺失株,研究其生物学特性及对Ⅵ型分泌系统(T6SS)的影响。利用Red同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌luxS缺失株,比较野生株、luxS缺失株的生长特性、运动性、生物被膜、致病性等生物学特性的差异。利用荧光定量PCR、Western-blot对luxS基因缺失株T6SShcp1、hcp2和clpV基因转录水平和蛋白表达水平进行检测。结果显示,LuxS对鼠伤寒沙门菌生长速度、生物被膜形成能力及细胞黏附侵袭能力均无明显影响,但导致其运动性显著增强、致病力下降3.2倍,且不能合成自诱导分子2。在对数生长期和平台期,luxS基因均不影响T6SS核心组分Hcp1、Hcp2和ClpV的转录和表达。本研究表明,luxS基因缺失导致鼠伤寒沙门菌运动能力增强及毒力降低,但其不能影响T6SS核心组分的转录及表达。     

稳定携带TAT-Apoptin融合基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌的构建及其基本生物学特性的测定

为构建能稳定携带TAT-Apoptin融合基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌,以pMD19-T-Apoptin为模板,PCR扩增出TAT-Apoptin融合基因,将其连接至pYA3493,构建了重组质粒pYA3493-TAT-Apoptin;然后将其电转至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd,并对该重组减毒沙门菌的生长特性、遗传稳定性和表达特性进行了测定。PCR和测序结果表明,成功构建了重组质粒pYA3493-TAT-Apoptin。进一步对重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-TAT-Apoptin)研究发现,其生长速度比强毒株SL1344明显减慢,与缺失株SL1344ΔcrpΔasd及互补菌株SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493)基本一致,且能够稳定遗传TAT-Apoptin融合基因。重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到TAT-Apoptin蛋白条带。以上结果证明,能稳定携带TAT-Apoptin融合基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-TAT-Apoptin)构建成功,且该重组菌能分泌性表达TAT-Apoptin蛋白。     

食品动物源沙门菌fosA_3基因的流行及传播特征

为研究质粒介导的磷霉素耐药基因fosA_3在食品动物源沙门菌中的流行状况及传播特征,采用PCR方法对本实验室保存的288株动物源沙门菌进行磷霉素耐药基因fosA_3、fosA和fosC2的检测,用琼脂稀释法测定阳性菌株对17种抗生素的敏感性,PCR检测其他相关耐药基因,玻片凝集法确定其血清型。采用脉冲场凝胶电泳(PFG E)和多位点序列分型(M LST)分析菌株间的亲缘关系。采用接合转移/转化、复制子分型、S1-PFGE和Southern杂交等对fosA_3的水平传播和质粒特征进行分析。结果显示,共筛选得到6株(2.1%)fosA_3阳性沙门菌,没有检测到fosA和fosC2。6株fosA_3阳性菌均表现出多重耐药,且同时携带blaCTX-M-9G(均为blaCTX-M-14)基因和floR基因,血清型检测均为印第安纳型。6株菌均为MLST(ST)17型,PFGE结果显示其图谱相似。质粒分析结果显示,fosA_3能通过IncN或IncA/C型质粒与blaCTX-M基因发生共同转移。本研究首次从国内不同地区采集的鸡粪便拭子样本中分离得到的沙门菌中检测到fosA_3基因,菌株的克隆传播和fosA_3与blaCTX-M随质粒的水平传播都加速了耐药性的散播,对公共卫生构成潜在威胁。     

鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为了探究5'-nucleotidase基因的功能及其在鼠伤寒沙门菌感染中的作用,本研究首先构建缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因的重组自杀性质粒pR E 112Δ5'-nucleotidase,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344Δ5'-nucleotidase缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。PCR及测序结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase构建成功,且回复株SL1344CΔ5'-nucleotidase构建成功。进一步研究表明,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因,生长速度没有发生明显改变。但是,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为4.30×10~7CF U,毒力降低至亲本株SL1344的1.96%。免疫保护率试验结果显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。缺失株免疫小鼠后第21天,血清抗体IgG水平达到最高。回复菌株与亲本亲株之间生物学特性无显著性差异,基本恢复到野生型水平。上述结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因与其致病力之间的关系提供了依据,并为研究它在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定了基础。     

鸡鲍氏志贺菌与痢疾志贺菌鸡白痢沙门菌及肠致病性大肠杆菌RAPD鉴别方法的建立

利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对鸡鲍氏志贺菌、鸡白痢沙门菌、肠致病性大肠杆菌和痢疾志贺菌的基因组DNA进行了研究,在此基础上分析了鸡鲍氏志贺菌与其他6个菌株的亲缘关系.结果显示,有4条随机引物的扩增多态性良好,共扩增出了64个DNA片段,其中4种菌共有的谱带有3条,而显示多态性的片段有61条,占95.3%.引物P2的扩增图谱不能将志贺菌和大肠杆菌鉴别开,但可将这2种菌与沙门菌鉴别出来;引物P6的扩增图谱清晰且3种菌间有明显差异,可用于上述3种细菌的鉴别.不同细菌间的遗传距离为0.128～0.790,根据遗传距离可将鸡鲍氏志贺菌等7个菌株分为3个聚类群,鸡鲍氏志贺菌分离株位于人痢疾志贺菌类群中,可能是人志贺菌的一个新的亚种.     

肉鸽都柏林沙门菌感染的检验与分析

沙门菌属(Salmonella)细菌的某些种(血清型) ,是引起禽类细菌性传染病的重要病原菌,在世界各地均有不同程度的暴发与流行,不仅影响禽的生长发育,降低其商品价值,甚至导致禽大批死亡,给养禽业造成严重的经济损失。在我国检出率较高的有鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和都柏林沙门菌等。笔者在禽病的研究工作中,对一起发生在肉鸽以纤维素性肺炎为主要特征病变的病例进行了检验,经对病原细菌分离、鉴定,确诊为由都柏林沙门菌所引起。1　发病情况与临床症状唐山某养殖户饲养的15 0只4 0日龄商品肉鸽突然发病,送检时已发…     

四川部分区域鸽源沙门菌携带情况的调查及其部分生物学特性的分析

为了解四川部分区域鸽源沙门菌的病原携带情况及分离菌的部分生物学特性,笔者采用RTPCR对四川部分区域采集的1 375羽赛鸽、信鸽的肛门拭子、粪便样本开展了沙门菌携带情况的调查,检测分离鉴定得到的沙门菌部分毒力基因。结果鉴定出52株沙门菌,检出率为3.85%(95%置信区间为2.81%～4.85%),以双流区、郫都检出率较高,分别为11.23%(9/81)和11.11%(10/89),各区域间检出率差异极显著(P0.01)。甲型副伤寒沙门菌、纽波特沙门菌均占定型菌株的11.9%,定型菌毒力基因sipC占比为92.85%,提示分离株有较强的入侵非吞噬细胞的能力。结果丰富了鸽源沙门菌携带情况的相关资料,为鸽源沙门菌的深入研究及防控提供了参考。