鹅胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的克隆及其mRNA在组织中的表达量变化

利用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)克隆了黑龙江籽鹅IGF-Ⅰ基因,并检测了生长期间该基因mRNA在各组织中的表达量变化。结果表明,鹅IGF-Ⅰ基因与鸡、鸭IGF-Ⅰ基因的同源性分别为97.6%、99.3%;鹅肝组织中IGF-ⅠmRNA的表达水平在30日龄和60日龄较高,而30日龄的表达量极显著高于22、28日龄鹅胚和1日龄籽鹅,显著高于10日龄雏鹅;30日龄雏鹅IGF-ⅠmRNA在肝、卵巢、胸肌、肺、脾、腿肌、垂体、肌胃、肾、心等组织中都有表达,其中肝、卵巢、胸肌、肺的表达量较高。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明代谢产物非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)和葡萄糖(GLU)在乳牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用,应用实时荧光定量PCR法观察了NEFA、BHBA和GLU对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体(GLNR)mRNA丰度的影响。结果,随着培养液中NEFA、BHBA和GLU浓度的升高,GLNR mRNA的表达量逐渐增加(P<0.01)。表明,代谢产物NEFA、BHBA和GLU直接调控乳牛肝胰高血糖素受体mRNA的表达。     

生糖底物和神经内分泌因子对新生犊牛肝细胞PEPCK-C mRNA表达水平的影响

在原代单层培养的新生犊牛肝细胞培养液中分别加入不同浓度丙酸钠、丙酮酸钠、胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白,培养12 h后,应用半定量RT-PCR方法检测体外培养的肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度。结果显示,随着丙酸钠、丙酮酸钠浓度的升高,肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度均先升高后下降(P<0.01);随胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白浓度的升高,肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度分别剂量依赖性地降低、升高(P<0.01)和无显著变化。表明,丙酸钠、丙酮酸钠能通过上调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK-C mRNA的表达而促进肝糖异生代谢,但上调作用是有限的;胰岛素能通过下调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK-C mRNA的表达而抑制肝糖异生代谢,且下调作用呈剂量依赖性;胰高血糖素与胰岛素作用刚好相反;瘦蛋白未起直接的调节作用。     

胰岛素样生长因子及其受体mRNAs在绵羊生殖系统中的表达和分布

为检测胰岛素样生长因子(IGFs)及其受体(IGFR)mRNAs在绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管中的表达,探讨绵羊胚胎早期发育过程中其发育环境——生殖道中生长因子的表达、分泌及其作用,取绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管,经固定、切片、免疫染色,观察IGFs mRNAs的表达和分布情况。同时用RT-PCR技术研究了各组织中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-ⅡR mRNAs的表达情况。结果表明,IGFs mRNAs在绵羊发情周期早期的卵巢、子宫和输卵管中都有表达,4种因子表达模式相似:在卵巢中,IGFs主要定位于卵泡颗粒细胞,间质细胞亦有少量表达。在输卵管中,上皮细胞免疫染色呈阳性;在子宫中,腺细胞及上皮细胞的阳性信号强于固有层。RT-PCR检测表明IGFs mRNAs在3种组织中均有表达。     

微量元素铜对软骨细胞胰岛素样生长因子mRNA基因表达的影响

分离培养仔猪关节软骨细胞,从中提取总RNA,采用RTPCR法扩增出关节软骨细胞中胰岛素样生长因子Ⅰ(IGFⅠ)的cDNA,与pMD18T载体相连,转化JM109大肠埃希氏菌,提取质粒,经鉴定,所扩增的片段为目的片段。在此基础上培养仔猪关节软骨细胞,并在培养液中添加不同水平的铜,分别在第0、12、24、48h收集软骨细胞,提取总RNA,采用RTPCR法扩增出IGFⅠ的cDNA,以βactin为内参,用凝胶分析系统对扩增出的cDNA进行扫描分析,计算IGFⅠmRNA基因表达的相对水平。结果,在细胞培养液中添加不同水平的铜能促进软骨细胞中IGFⅠmRNA基因表达,其中以铜浓度31.2μmol/L的效果最好。表明铜对软骨细胞的增殖作用是通过促进IGFⅠmRNA的表达来实现的。     

摄入不同能量的围产期乳牛肝低密度脂蛋白受体 mRNA丰度的比较

将30头健康、经产、处于围产期的黑白花乳牛随机分为3组,每组10头。从产前28 d开始,低能量组乳牛饲喂《中国奶牛饲养标准(2000)》减少20%日粮(能量摄入80%),对照组乳牛饲喂《标准》日粮(能量摄入100%),高能量组乳牛饲喂《标准》增加20%日粮(能量摄入120%),产后各组乳牛均饲喂标准日粮,至产后第56 d结束试验;采用内对照RT-PCR方法检测摄入不同能量的围产期乳牛肝活体组织低密度脂蛋白受体(LDLR)mRNA丰度。结果,不同能量组乳牛肝LDLR mRNA丰度产前至产后均呈现先升高后降低的趋势,100%和120%能量组肝LDLRmRNA丰度在产后14 d达最大值,且产后均高于产前(产后56 d除外,P<0.01或P<0.05);而80%能量组产后1 d即达到最大值,产前14 d至产后14 d,LDLR mRNA相对表达量显著高于100%和120%能量组;产后28~56 d,120%能量组显著高于80%和100%能量组(P<0.01)。表明围产期乳牛能量摄入水平对肝LDLR mRNA丰度有显著影响。     

新生犊牛小肠黏膜结构的早期发育及上皮内淋巴细胞和杯状细胞的数量变化

应用组织学和组织化学方法研究了1日龄和20日龄新生犊牛小肠黏膜结构的早期发育及部分黏膜免疫相关细胞的分布与数量变化规律。结果显示,从1日龄到20日龄,小肠绒毛变短,尤其十二指肠的绒毛长度约缩短了61.58%(P<0.05),绒毛长度与隐窝深度比值(V/C比值)减小了59.04%~91.32%(P<0.05);而黏膜和肌层厚度分别增加了8.66%~41.28%和36.22%~299.10%。小肠各段上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量随年龄增长而逐渐增多(P<0.05),20日龄比1日龄分别增加了78.80%~163.05%和28.23%~101.46%;但比较同一年龄的小肠不同肠段,从十二指肠至回肠,上皮内淋巴细胞的数量逐渐减少,而杯状细胞的数量则呈增多趋势。     

β-防御素caBD-1 mRNA在骆驼组织器官中的表达

根据已知的骆驼 β 防御素caBD 1cDNA序列设计了 1对预计扩增产物为 2 0 3bp的引物 ,通过RT PCR检测骆驼的整个消化道黏膜、肝、胰腺、气管黏膜、肺、肾、膀胱黏膜、卵巢、子宫内膜、脾、淋巴结、心等器官内caBD 1mRNA的表达。结果显示 :caBD 1mRNA在整个消化道、气管、膀胱、子宫等管状器官内的黏膜层有表达 ,而在实质性器官如心、肝、胰腺、肺、脾、淋巴结、卵巢、肾中无表达。提示 ,骆驼体内的这种内生性抗微生物肽有助于骆驼的黏膜宿主防御     

沂蒙黑山羊发情周期中输卵管促性腺激素受体基因的表达差异研究

采用RT-PCR方法,以持家基因GAPDH为内参,研究沂蒙黑山羊发情周期中卵泡刺激素受体(FSHR)mRNA和黄体生成素受体(LHR)mRNA在输卵管中的表达差异。结果表明,发情周期中促性腺激素受体mRNA在输卵管中都有表达。漏斗部FSHR mRNA在间情期的表达量最高,发情期表达量最低,且发情期与其他3个时期差异极显著(P<0.01)。壶腹部在间情期的表达量最高,发情前期表达量最低,间情期与其他时期差异极显著(P<0.01)。在峡部则是发情后期表达量最高,发情前期最低,发情前期与其他3个时期差异极显著(P<0.01)。LHR mRNA表达量与FSHR mRNA呈相反规律,以发情期漏斗部相对表达量最高,与其他部位差异极显著(P<0.01)。研究结果显示,发情周期中促性腺激素受体基因在输卵管中呈规律性的动态变化。表明,在动物排卵、受精及早期胚胎发育过程中促性腺激素受体mRNA起着一定的调节作用。     

TGF-β1对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA表达的影响

为研究外源性TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞表达CTGF mRNA的影响,用组织块法体外培养和纯化出奶牛乳腺上皮细胞,并应用免疫组织化学的方法鉴定细胞的纯度。然后用不同浓度的外源性TGF-β1(0,1,5,10ng/mL)作用乳腺上皮细胞,作用12,24,48,72h后分别提取细胞的总RNA,以β-actin作为内参基因,用实时荧光定量RT-PCR方法测定CTGF mRNA相对表达量的变化,并对CTGF的PCR产物进行测序分析。结果显示,TGF-β1处理组(1,5,10ng/mL)较对照组(0ng/mL)差异显著(P<0.05);处理组CTGF mRNA的相对表达量显著升高,并呈正量效关系:随着TGF-β1浓度的升高,CTGF mRNA的相对表达量基本呈逐渐升高的趋势。测序分析结果证明扩增产物为牛的CTGF基因序列,表明外源性TGF-β1可显著促进奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA的表达,进而在奶牛乳腺纤维化过程中发挥作用。     

氨肽酶N mRNA在雏鸡不同组织中的表达情况

为揭示鸡氨肽酶N(cAPN)含量差异与传染性支气管炎病毒(IBV)组织嗜性之间的关系,以看家基因鸡β-actin为内参基因,与cAPN目的基因在相同体系中扩增,以cAPN-pMD18-T标准质粒扩增曲线为标准,计算内参基因及目的基因各自的表达量,并将二者的比值作为相对定量依据,比较不同日龄雏鸡各组织cAPN含量的不同.结果显示,随着日龄增加,肝、脾、法氏囊、回肠、肾等组织中的cAPN表达量相对稳定,肺、腺胃、空肠等组织中的cAPN表达量呈现持续下降趋势,而十二指肠中的cAPN表达量持续上升,但盲肠、空肠中的cAPN表达量规律性不强且波动较大.表明cAPN的表达与IBV亲嗜组织存在着密切的相关性,同时也侧面反映了IBV组织嗜性的差异在一定程度上取决于机体不同组织器官cAPN的含量差异.     

甘肃省庆阳市犊牛瞎眼病的调查与预防

对甘肃省庆阳市的西峰、合水、庆城、华池、镇原 5个县 (区 )牛群流行的以犊牛双目失明为主要症状的疾病进行了流行病学调查、临床症状和病理变化观察、实验室检验、小白鼠和兔饲喂试验及本动物典型病例复制试验 ,结合流行区种植黄花菜的情况 ,综合诊断为萱草根素中毒。经采取限制牛放牧时间 ,避免或杜绝牛在每年冬春季节采食黄花菜根及其青苗等措施 ,流行区牛的发病数量明显下降。     

牛源支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

从2008年黑龙江省某奶牛场犊牛中暴发的一种以呼吸道病变为主疾病的患病牛中分离出3株细菌,根据其形态特征、培养特性、生化特性等将分离菌鉴定为支气管败血波氏杆菌.对分离菌进行药敏试验、皮肤坏死试验及16 S rRNA基因的克隆和序列分析.结果显示,该菌对氟哌酸、丁胺卡那霉素、庆大霉素、氯霉素敏感,可导致豚鼠皮肤坏死;其16 S rRNA基因序列与GenBank中收录的标准菌株Bb RB50株(BX640449)同源性为100%.证实,引起该病的病原是支气管败血波氏杆菌.     

鸡白细胞介素-2受体基因γ链的转录分析与表达

以脾单个核细胞总RNA为模板,对鸡白细胞介素-2受体基因γ链(chIL-2Rγ)进行了RT-PCR,获得了一1 047 bp的开放阅读框,编码由348个氨基酸残基组成的分子质量为37.8 ku的蛋白多肽。预测的鸡IL-2Rγ多肽链中包含4个保守半胱氨酸残基、1个WSXWS基序和7个N连接的糖基化位点。鸡IL-2Rγ与其他动物IL-2Rγ在氨基酸水平上的同源性仅为21.4%~38.2%。RT-PCR检测发现,鸡IL-2RγmRNA分布于大脑、小脑、脊髓、腔上囊、脾、胸腺、骨髓、盲肠扁桃体、腺胃、肌胃、空肠、卵黄囊憩室、回肠、盲肠、直肠、心脏、肾、肺、肝、骨骼肌和皮肤,而在十二指肠和睾丸中没有检测到其转录。构建了鸡IL-2Rγ胞外区的原核重组表达载体,进行了表达和鉴定。     

肉雏鸡肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶mRNA表达产物的RT-PCR检测

细胞谷胱甘肽过氧化物酶 (cGPX)是动物体内一种重要的抗氧化酶。建立了利用RT PCR并以 β 肌动蛋白 (β Actin)为内参照定量分析cGPXmRNA表达的方法。提取肉鸡肝总RNA ,经反转录和PCR扩增 ,PCR产物的电泳条带于VDS摄像系统扫描灰度。寻求PCR线性扩增范围 ,确定RT PCR的最佳循环次数和模板量。通过计算cGPXPCR产物与 β 肌动蛋白PCR产物的灰度之比 ,即可得出cGPXmRNA的相对含量。     

犊牛前脂肪细胞的培养及其增殖与分化模型的建立

选择犊牛小肠网膜、附睾脂肪垫、腹部皮下脂肪组织材料 ,应用原代消化细胞培养法培养细胞。结果 ,由小肠网膜培养出了成分均一、增殖旺盛、分化率高的梭形细胞。经形态学动态变化观察、生长曲线测定、油红O脂肪染色及对胰岛素反应的测定 ,证明为功能活跃的前脂肪细胞 ,并在体外重现了其增殖、肥大的全过程。结果显示 ,小肠网膜脂肪组织存在着功能活跃的可调控的前脂肪细胞     

乳牛瘦蛋白基因荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中瘦蛋白(leptin)基因序列设计合成了引物和探针,对荧光定量PCR的方法进行了方法学的评估,建立了TaqmanMGB荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,由 pMD-18T瘦蛋白所构建的标准曲线线性关系良好,建立的瘦蛋白基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强(可检测出低于10个拷贝／μL的样品),准确可靠。     

乳牛肝MTP基因mRNA定量检测模板的构建

应用RT-PCR方法,克隆394 bp的MTP片段,连接到pMD 18-T载体上构建pMD-MTP394重组质粒;应用限制性内切酶ApaⅠ消化重组质粒pMD-MTP394,切下一194 bp的小片段,回收大的线性片段,T4 DNA连接酶连接,成功构建了一个重组的竞争模板质粒pMD-MTP200,为建立竞争性RT-PCR法检测乳牛肝MTP基因mRNA奠定了基础。