禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒VanRoekel(AEVVR)株通过SPF鸡胚传代复壮 ,获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒 114 3(AEV 114 3)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VP1基因序列 ,设计了 3对引物 ,分别扩增AEVVR株的VP0、VP3、VP1基因 ,将RT PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明 ,AEVVR株与AEV 114 3株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为 95 .1%、93.6 %和 93.9% ;氨基酸的同源性分别为 97.5 %、97.5 %和 99.6 %。     

禽脑脊髓炎病毒的提纯和电镜观察

将禽脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）ＶａｎＲｏｅｋｅｌ株、１１４３株和ＮＨ９３７株分别经卵黄囊接种于６日龄ＳＰＦ鸡胚，接毒１０日后解剖鸡胚，收集尿囊液，采集脑、消化道和胰腺，用玻璃匀浆器制备２０％的组织悬液。组织悬液经３次冻融充分破坏细胞，释放病毒，然后以４００Ｏｒ／ｍｉｎ离心２０分钟，１００００ｒ／ｍｉｎ离心４０分钟。上清液经浓缩后轻轻加入已含２ｍｌＣｓＣｌ不连续密度梯度的５ｍｌ离心管内，再以４５０００ｒ／ｍｉｎｌ２℃离心２小时，在ＣｓＣｌ连续密度梯度内取出含ＡＥＶ的组分后经对蒸馏水透析除去ＣｓＣｌ，对聚乙二醇－６０００透析浓缩。病毒样本经１％磷钨酸负染后用透射电镜观察见到典型的ＡＥＶ粒子。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

从含有鹅细小病毒 (GPV)H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEXHTb VP3中切取GPVH 1株VP3基因片段 ,将其亚克隆于 pSY5 3 8的EcoRⅠ位点 ,并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaⅠ位点 ,再用NotⅠ切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段 ,亚克隆于pSY681的NotⅠ位点 ,构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)Van Roekel株作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法(IFA)和免疫组织化学法鉴定,经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2,制备了腹水,并利用该单克隆抗体初步建立了Dot-ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。     

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒 (GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPVH1株VP1的 1对引物 ,利用PCR技术扩增出长约 2 .2kb的目的片段 ,将其克隆到 pMD 18 T载体上 ,进行了序列测定及分析。测序结果表明 ,GPVH1株VP1基因由 2 199个核苷酸组成 ,编码 732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较 ,核苷酸的同源性分别为 98.5 0 %和 93.18% ;推导的氨基酸同源性分别为 98.0 9%和 95 .77%。     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒 (IBDV )YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析 ,并和相关毒株进行了比较。结果表明 ,YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有 92 .5 %和 91.8% ,与超强毒株UK6 6 1的核苷酸和氨基酸同源性均为97.6 % ,而与当地鸡群中分离的超强毒株HN94 2的核苷酸和氨基酸同源性则高达 98.1%和98.4 % ,该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物,应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段.将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR 3.1 T载体上,MDPV YZ株基因大小为1764 bp,编码528个氨基酸,并对插入片段进行序列测定.测定结果表明,我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%.     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列,设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物.以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板,用RT-PCR扩增出了1.45 kb的cDNA产物,将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上,获得了pMD 18-T-VP2重组质粒.将IBDV HN01株 VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较,绘出系统进化树.结果表明,HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大.     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

禽流感病毒N8亚型神经氨酸酶基因的克隆和全序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒A/Duck/Australia/341/83(H15N8),通过RT-PCR获得了NA基因全长,连接并转化,增菌培养后,提取阳性质粒进行序列测定,获得了禽流感病毒N8亚型的NA基因序列,分析了NA8基因与其他流感病毒神经氨酸酶基因的相互关系。结果显示,所获得的NA基因片段全长1459bp,最大开放阅读框编码457个氨基酸残基,经Blast分析,该基因与GenBank中其他13株N8亚型毒株的NA基因核苷酸序列同源性为91.6%～73.3%。与其他8个N1～N9亚型NA基因进行遗传演化分析,N8亚型与N5亚型NA基因的亲缘关系最近,与N3亚型NA基因的亲缘关系最远。结果表明,禽流感病毒N8亚型NA基因序列的测定对N8亚型流感病毒的诊断和预防具有重要意义。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及其N基因片段的克隆和测序

通过形态学观察、动物回归试验、鸡胚接种试验、病毒干扰试验以及血凝试验分离鉴定了1株肾型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。在透射电子显微镜下,病毒粒子多呈球形,直径为80~120 nm,有囊膜,表面有冠状突起。鸡胚连续盲传至第 1~2 代,开始出现死亡或出现侏儒胚;分离株可显著干扰NDV在鸡胚中的增殖;病毒尿囊液无凝血活性,但经5 g/L胰蛋白酶处理后,能够凝集10 mL/L的鸡红细胞。利用RT PCR技术对分离株的N基因进行了扩增,经克隆、序列测定和分析比较,证实分离株为肾型IBV,命名为AH3 04株。     

鸭源H9N2亚型流感病毒NS基因的克隆及表达

根据GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的NS基因序列设计合成了 1对引物NSU/NSL ,利用RT PCR扩增出了H9N2株NS基因 ;将该基因片段克隆到 pMD 18 T载体上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果 ,获得了NS基因片段的阳性重组子 ,扩增的NS基因包含NS1基因完整的阅读框架和部分NS2基因 ,其序列与GenBank中收录的其他分离株NS基因比较 ,同源性达 96 %～ 99%。再将克隆的NS基因插入到原核表达载体 pET 2 8a后 ,转化E .coliBL2 1(DE3)感受态细胞 ,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达 ,所表达蛋白质的分子质量约为 30ku。     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段,将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。