大鼠神经干细胞的分离培养和分化

分离大鼠大脑皮质及皮质下组织 ,经消化及机械吹打后 ,用悬浮培养法、有限稀释法获得来源于同一细胞的亚细胞系克隆 ;用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞 (NSCs)。结果 ,从大鼠大脑皮质及皮质下分离的组织 ,经原代和传代培养均可形成细胞克隆 ,并具有增殖能力 ;原代和传代细胞抗原与抗巢蛋白 (nestin)单克隆抗体反应呈阳性 ;单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结果表明 ,用此方法分离的细胞具有自我更新和分化潜能 ,有很强的增殖能力 ,是属于中枢神经系统的干细胞。     

兔脂肪间质干细胞的分离培养与鉴定

取兔腹股沟皮下脂肪组织,用Ⅰ型胶原酶消化,分离培养脂肪间质干细胞(MSCs),并用免疫组化和体外诱导分化方法对其表面分子标志和多向分化潜能进行鉴定。结果显示,兔脂肪组织中能够分离培养出脂肪MSCs,该类细胞表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45及HLA-DR表面分子标志,并具有可分化为脂肪细胞、神经细胞和成骨细胞的多向分化潜能,证实兔脂肪组织中存在具有多向分化潜能的MSCs。     

猪胚胎多能性干细胞的分离培养

收集妊娠 2 6 .0～ 2 9.0d的猪胚胎 ,分离培养原始生殖细胞 (PGCs) ,在STO细胞饲养层上生长 ,形成了多能性干细胞 (EG)。发现其具有干细胞的显著特性 ,并能在体外定向分化为神经细胞、上皮细胞和胚泡细胞。试验使用A、B、C 3种不同的培养基培养PGCs ,结果在形成EG细胞集落的数量和EG细胞分化上有着明显的差距 ,说明血清的质量和浓度以及细胞因子对干细胞的生成和增殖有着重要的影响     

山羊成骨细胞的体外培养和鉴定

采用初生山羊羔股骨骨膜,通过植块培养法、完全消化法和半消化植块法分离、培养成骨细胞。结果表明,植块培养法、完全消化法和半消化植块培养法的贴壁时间分别为4、24、4 h;培养4 d时的细胞数量分别为少量细胞、少量细胞、大量细胞,细胞汇合时间分别为21、19、10 d。传代后第7 d即可汇合,第14 d出现矿化结节,茜素红染色呈橘红色,Von Kossa染色呈黑色;姬姆萨和HE染色后可见体外培养的细胞呈三角形、多角形,胞质丰富,胞核卵圆形,单核,有1~3 个核仁;碱性磷酸酶染色后胞质呈黑色颗粒或块状沉淀;扫描电镜观察胞突发达,伸出的突起与临近细胞的突起相连。体外培养传至15代时细胞的生物学性状未发生变化。试验结果显示,半消化植块培养周期短,细胞损害小,有利于细胞贴壁,是一种可行的骨组织工程研究方法。     

山羊溶血性曼氏杆菌2型的分离鉴定

为了确定某养殖场奶山羊细菌性感染导致死亡的具体病原种类,从送检的肺和肝组织病料中分离纯化细菌。通过生化培养特性观察、16S rRNA和毒力基因的PCR扩增、血清型鉴定、药敏试验和致病性试验来鉴定病原种类。结果显示,从送检的组织中分离出2株革兰阴性球杆菌;16S rRNA和毒力基因LKT测序结果表明,所分离的病原菌为溶血性曼氏杆菌,血清型鉴定均为溶血性曼氏杆菌A2型,故可确定分离株为具有致病性的溶血性曼氏杆菌2型。药敏试验结果显示,分离株对羧苄西林、庆大霉素敏感,对氨苄西林、卡那霉素等中度敏感,而对复方新诺明具有耐药性。小鼠致病性试验表明,接种分离株后小鼠于24 h内陆续死亡,并从剖检小鼠肺中也检测到溶血性曼氏杆菌,表明该菌有一定的致病力。结果表明,造成山羊死亡的主要病原是溶血性曼氏杆菌,这为溶血性曼氏杆菌病的临床用药提供了参考。     

山羊支原体山羊肺炎亚种黏附相关蛋白的特性

为鉴定山羊支原体山羊肺炎亚种的黏附相关蛋白,通过对山羊支原体山羊肺炎亚种基因组编码的假定的膜蛋白基因(0297)进行扩增,并连接到pET-32a(+)载体,转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得了以可溶形式表达的重组蛋白,大小约为43ku,将该重组蛋白命名为P0297。用纯化的P0297免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。利用激光共聚焦显微镜观察到蓝色的细胞核周围有重组蛋白的绿色荧光存在,其外形与细胞膜的红色荧光基本重合,表明P0297对山羊气管上皮细胞有明显的黏附作用。夹心ELISA结果显示,重组蛋白P0297的黏附作用与蛋白浓度成正比,并且黏附作用可被多克隆抗体阻断,说明该重组蛋白的黏附为特异性黏附。上述结果表明,P0297蛋白是山羊支原体山羊肺炎亚种的一个黏附相关蛋白。     

环腺苷酸对体外培养的山羊乳腺上皮细胞增殖的影响

用环腺苷酸 (cAMP)对体外培养的山羊乳腺上皮细胞 (GMEC)进行试验 ,将细胞分为 8组。第 17组分别加入 1× 10、1× 10 2 、1× 10 3 、1× 10 4、1× 10 5、1× 10 6、1× 10 72nmol L的cAMP ;第 8组不加cAMP为对照组。结果显示 ,第 16组细胞倍增时间随cAMP浓度升高而递减 ,分别为 31.7、2 9.8、2 7.8、2 5 .6、2 3.8和 2 2 .0 2h ;当cAMP浓度达到 1× 10 72nmol L时 ,细胞倍增时间反而延长 2 6 .5 2h ,对照组细胞倍增时间为 30 .6 2h。结果表明 ,在一定浓度范围内 ,cAMP对GMEC有促进增殖作用 ,当cAMP浓度过高时则有抑制作用。cAMP对该细胞生长曲线的影响是在对数生长期。Westernblot结果证实 ,体外培养的细胞为GMEC ,cAMP诱导了该乳腺上皮细胞特异性产物酪蛋白的表达。     

山羊背根神经节神经细胞的原代培养及鉴定

从胎龄3个月左右的山羊胚胎中分离出背根神经节,采用组织块培养法,利用血清培养和无血清培养,并在非神经细胞抑制剂作用的条件下,观察了山羊背根神经节神经细胞在体外的生长状况,采用免疫荧光和RT-PCR技术对神经细胞表面标志神经元特异性磷酸化酶(NSE)进行了鉴定。结果显示,接种48h后的细胞从组织中迁出,并长出突起,经阿糖胞苷作用后,神经细胞与非神经细胞分层;经免疫荧光鉴定,上层细胞为神经细胞。随着时间的增加,神经细胞突起延长并交错成网状,至第6～10天神经细胞形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经细胞最长可生存32d。表明本试验成功分离培养得到了山羊背根神经节神经细胞。     

樱桃谷鸭心肌细胞的分离培养与传代研究

为寻找一种经济、可重复的鸭心肌细胞最适培养技术,利用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法分离樱桃谷鸭心肌细胞,并对培养条件和生长特性进行摸索。用台盼蓝染色法检测培养细胞的活性,用HE染色法检测培养细胞的形态,并用抗α-actin蛋白免疫组织化学染色法鉴定培养的心肌细胞。结果表明,通过差速贴壁法分离的心肌细胞在前3代可观察到节律性搏动,α-actin染色阳性,心肌细胞数量较大,活力高,形态呈梭形、星形和多角形。证实,通过酶消化法和差速贴壁法分离到的鸭心肌细胞,可连续传代至12代,细胞纯度及数量能满足心肌细胞研究的需要,为一种可行的鸭心肌细胞培养方法。     

新生猪胰腺干细胞培养方法的建立

通过对不同饲养层和培养基以及细胞因子进行筛选,比较了各种培养基和细胞生长因子对细胞传代时间和增殖细胞比例的影响,选择最佳分离条件,建立了新生猪胰腺干细胞体外培养的最佳体系。结果显示,以成纤维细胞为饲养层,在含100 mL/L胎牛血清的L-DMEM中添加表皮生长因子、干细胞因子、白血病抑制因子的培养液中培养,细胞能快速增殖,多突起、多角形、小圆形、长梭形4种类型干细胞的增殖比例适中,而且各种类型的细胞都能长期传代培养。     

昆明白小鼠胚胎生殖细胞的分离与培养

以昆明白品系小鼠胎儿生殖嵴为材料,以不同的培养液分离培养胚胎生殖细胞(EGcells),发现小鼠胎儿肝细胞条件培养液的效果好于未添加白血病抑制因子(LIF)的基础培养液,而差于添加了1 000 IU/mL LIF的基础培养液。同时,试验对比了从不同胎龄胎儿分离培养原始生殖细胞(PGCs)的情况,鉴定了EG细胞的生物学特性;EG细胞经体外培养,可以分化为神经样细胞、上皮样细胞和简单类胚体。     

褪黑激素对犬脂肪干细胞向雪旺细胞分化过程中凋亡发生的抑制作用研究

为了探讨褪黑激素(Mel)对犬脂肪干细胞(ADSCs)向雪旺细胞(SCs)诱导分化过程中凋亡发生的影响。本实验将犬ADSCs诱导分化为SCs,并使用免疫荧光法进行鉴定。采用CCK8法选取Mel的最佳浓度。应用q RT-PCR法和Western-blot法检测无Mel组和Mel处理组中ADSCs向SCs诱导过程中细胞凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2和Bax的m RNA和蛋白表达水平。结果显示,50 nmol/L Mel处理过的细胞活力最高;ADSCs向SCs诱导后S-100和GFAP呈阳性表达,并且观察到Mel的添加并不会影响到SCs的表型特征。ADSCs向SCs诱导后Bcl-2表达量明显低于对照组,Caspase-3、Caspase-8和Bax的表达量显著高于对照组,细胞凋亡较多;在加入Mel后Bcl-2表达量显著升高,Caspase-3、Caspase-8和Bax的表达量显著下降。结果说明Mel可以显著抑制犬ADSCs向SCs诱导分化过程中的凋亡发生。     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示,猪的卵丘细胞生长形成单层需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10~11 d和8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

仔猪胰腺干细胞的多向分化潜能

以分离自1日龄仔猪体内的胰腺干细胞为检测细胞,诱导其向胰腺β细胞和三胚层功能性细胞分化,以证实分离的胰腺干细胞具有多向分化潜能。采用RPMI 1640培养液添加烟碱和肝细胞生长因子诱导胰腺干细胞向β细胞分化;添加5-氮胞苷向心肌细胞诱导;用地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸盐联合向成骨细胞诱导;用不同浓度的β-巯基乙醇作用不同时间向神经细胞诱导。结果表明,分离的仔猪胰腺干细胞在向胰腺β细胞诱导后,表现出胰岛素特征性双硫腙染色阳性,不同浓度的葡萄糖刺激诱导胰腺干细胞可分泌一定量的胰岛素;向心肌细胞诱导后,表现心肌细胞的α-actin和肌糖原阳性;向成骨细胞诱导后,细胞表现成骨细胞的碱性磷酸酶阳性和基质细胞钙离子茜素红染色阳性;向神经细胞诱导后,表达神经细胞的神经胶质纤维酸性蛋白、髓磷脂碱性蛋白、神经丝蛋白-200等多种表面标志。证实分离的仔猪胰腺干细胞具有向三胚层功能性细胞分化的多向分化潜能。     

干细胞的新来源——羊膜

为了给羊膜干细胞深入研究提供借鉴,介绍了羊膜的组织特点,综述了羊膜上皮干细胞及羊膜间充质干细胞的生物学特性及其诱导的潜能和鉴定方法,并对其在临床医学应用的前景进行了展望。提出羊膜组织来源的干细胞为干细胞的研究提供了新来源、新思路。