马立克氏病毒单克隆抗体的制备及应用

用ＭＤ＿（１１）／７５ｃ，ＳＢ＿１，ＨＶＴ＿（ＦＣ１２６）三个马立克氏病毒株分别免疫Ｂａｌ／ｃ小鼠，获得１０株分泌抗马立克氏病毒（ＭＤＶ）单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为ＦＭ＿３、ＦＭ＿（１７）、ＦＭ＿（２４）、ＦＭ＿（２８）、ＦＭ＿（４２）、ＦＭ＿（４５）、ＦＭ＿（６２）、ＦＭ＿（５３）、ＦＭ＿（５４）、ＦＭ＿（１５９）．这些单克隆抗体都具有免疫萤光反应特性，其腹水抗体的ＦＡ效价为１０￣３～１０￣５，其中ＦＭ＿３、ＦＭ＿（４２）、ＦＭ＿（５３）、ＦＭ＿（１５９）等单抗具有ＥＬＩＳＡ特性，腹水抗体效价为１０￣３～１０￣５。ＦＭ＿（１５０）识别血清Ｉ型ＭＤＶ；ＦＭ＿３、ＦＭ＿１７识别血清Ｉ型ＭＤＶ；ＦＭ＿（５３）、ＦＭ＿（５７）识别血清Ⅲ型ＭＤＶ；ＦＭ＿（４５）识别血清Ｉ和Ⅱ型ＭＤＶ；ＦＭ＿（２４）识别血清Ⅱ型和Ⅲ型ＭＤＶ；ＦＭ＿（４２）能识别三个血清型ＭＤＶ。这些单克隆抗体可用于ＭＤ早期诊断，和疫苗质量的监测。     

马立克氏病病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得分泌抗鸡马立克氏病病毒(MDV)gE囊膜糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将pGEX-6P-1表达的重组蛋白gE作为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,共筛选获得4株能够稳定分泌抗MDV gE蛋白抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚型鉴定结果表明,4株均为IgG1型,轻链为κ链。间接免疫荧光结果显示,4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能特异性识别MDV,并具有一定的中和活性。本研究对MDV诊断、抗原表位分析及鉴定等具有重要的应用价值。     

蓝舌病病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

以纯化的蓝舌病病毒(BTV)11型VP7免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,借助间接ELISA筛选,获得了3株分泌抗BTV11 VP7的群特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名为C12D9、B4 F3、E1 A7.这3株杂交瘤细胞株连续传代3个月再经液氮冻存6个月后复苏培养,仍能稳定分泌特异性McAb.3株McAb均具有ELISA特性和免疫沉淀特性,其中C12D9株上清液的ELISA效价为1256,腹水的ELISA效价为10-6.亚类鉴定,C12D9株为小鼠IgG1,B4F3、E1 A7为IgG2a和IgG2b.琼脂免疫扩散试验和间接ELISA试验表明,这3株均与BTV11型VP7发生特异性反应,为BTV群特异性McAb.     

牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定

为进一步研究牛IFN-γ(BoIFN-γ)单克隆抗体在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用,用原核表达的重组牛IFN-γ(rHis-BoIFN-γ)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,免疫3次后取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3～5次亚克隆,最终获得12株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。Ig亚类鉴定结果显示这12株杂交瘤细胞均为IgG,其中5株为IgG1,3株为IgG2a,4株为IgG2b。这12株杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的能力。Western-blot及间接ELISA证明这12株单克隆抗体均可特异性地结合rBoIFN-γ蛋白。间接免疫荧光试验显示,这12株单抗均与真核细胞BHK-21表达的rBoIFN-γ产生荧光反应,证明这些单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。ELISA叠加试验表明,3C2与1H4、1G6与1G4针对不同表位,1A10、1B2、2B9、3C4四株和1C1与1G6、1G4与3C2、1A10与1G8针对相同或相近的表位。     

抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建好的pET-30a重组菌E.coli Rosetta(DE3)表达鹅细小病毒(GPV)VP3重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后作为免疫原,经腹膜腔接种4～6周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫后第3d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用建立的间接ELISA方法进行筛选,经4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPVVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11和4A2。亚类鉴定结果显示,单抗1F1为IgG2b亚型,其余3株单抗为IgG1亚型,轻链均为κ链。经间接ELISA检测,单抗1F1、2A9、3B11和4A2的腹水效价分别为1:819200、1:1638400、1:409600和1:819200。Western-blot分析表明,获得的4株单克隆抗体均能特异性识别GPVVP3重组蛋白;间接免疫荧光试验证明,这4株单抗能够与天然GPV结合。     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

抗水貂肠炎病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

将水貂肠炎病毒SMPV-11株纯化后免疫4～6周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,获得了8株稳定分泌抗水貂肠炎病毒SMPV-11株单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为D3、H5、F5、F4、A9、B7、H11和H8.经过鉴定:其腹水ELISA效价分别在1:6.4×103和1:2.56×104之间;且与犬瘟热病毒、阿留申病病毒、犬腺病毒不发生交叉反应;而与水貂肠炎病毒、犬细小病毒和猫泛白细胞减少症病毒呈特异性反应;这8株单克隆抗体均为IgG类型.     

H3N8亚型马流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其生物学特性的研究

为了构建表达H3N8亚型马流感病毒HA蛋白的重组腺病毒,把A/Equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA基因克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,将重组穿梭质粒pShuttle-XJ3HA电转化至BJ5183感受态细胞中,与人5型腺病毒骨架质粒同源重组,获得了重组腺病毒质粒pAd-XJ3HA。该质粒线性化后转染AD293细胞,包装重组腺病毒rAd-XJ3HA。通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot鉴定,证明HA基因已整合到腺病毒载体基因组中,并能够有效表达。该重组腺病毒在AD293细胞上连续传15代后仍表现出良好的遗传稳定性。马流感病毒HA基因重组腺病毒的成功构建为我国马流感重组病毒活载体疫苗的研究提供了技术储备。     

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。     

旋毛虫单克隆抗体特性鉴定

将两株抗旋毛虫单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞（Ｄ４,Ｅ２）所分泌的ＭｃＡｂ,经纯化后电泳分析,其重链分子质量为５５ｋｕ,轻链分子质量为２９ｋｕ,符合ＩｇＧ抗体的特点。两株ＭｃＡｂ与旋毛虫阳性猪血清所针对的旋毛虫抗原决定簇相同,都不与猪的其它寄生虫发生交叉反应,与抗原的相对亲和力Ｅ２＞Ｄ４,ＭｃＡｂ亲和层析纯化抗原的分子质量为４９ｋｕ,经免疫斑点染色证明为糖蛋白。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。     

鹌鹑减蛋综合征病毒单克隆抗体的制备及生物学特性

以鹌鹑减蛋综合征QAV C94病毒为抗原免疫BALB/c小鼠 ,制备单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。获得 5株分泌单克隆抗体的细胞株 (命名为H1、H3、H4、H6和H8)。这 5株杂交瘤细胞可长期稳定地分泌单克隆抗体 ,分泌的单克隆抗体为IgG2a亚类 ,具有高度的特异性 ,只特异地作用于鹌鹑减蛋综合征病毒 ;微量血凝抑制试验显示H4有血凝抑制活性 ,腹水效价为 1∶2 6 ;这 5株单克隆抗体都没有沉淀活性 ,也不与CELO抗原发生沉淀反应 ;它们的亲和力以H4最大 ,相对亲和力依次为H4 >H6 >H1 >H8>H3。     

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以原核表达的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP2蛋白免疫BALB/c小鼠3次后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合;融合细胞用间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)检测;阳性细胞株经3次有限稀释法克隆后,获得7株分泌抗CIAV VP2蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为3B4、3C9、3D7、3D10、4G11、4G7和5C6。7株杂交瘤细胞免疫小鼠的腹水及其细胞培养液上清的ELISA效价分别是2.0×106、2.5×105、1.0×106、2.0×105、2.5×104、1.5×106、1.0×105和1.5×102、1.0×102、2.5×102、2.0×102、0.5×102、2.5×102、1.5×102。7株融合细胞的染色体数目为98~102条,与其他禽类病毒和MSB1、Sf9细胞无交叉反应,说明这7株单抗具有良好的特异性。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒荧光标记单克隆抗体的制备及鉴定

为制备可以区分牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因型的荧光标记单克隆抗体,分别利用分泌抗牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒(BVDV-Ⅰ)、牛病毒性腹泻Ⅱ型病毒(BVDV-Ⅱ)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ)单克隆抗体的杂交瘤细胞株BV1、BV2、BV12,腹腔接种BALB/c小鼠,大量制备单克隆抗体,用辛酸-硫酸铵法提纯,经活性、浓度、纯度检测合格后,利用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联,制备成3种荧光标记单抗。结果显示,3种标记单抗的F/P比值范围均在2.0～4.0之间;细胞DFA法测定其效价均≥1∶200;抗原交叉试验证实标记单抗的特异性良好;标记单抗可以检测到1TCID50的病毒粒子;临床初步应用表明,3种标记单抗的阳性检出率均≥95%,与进口BVDV荧光抗体的符合率为100%。3种荧光抗体的研制对BVDV基因分型鉴定、NCP型BVDV的鉴定以及BVDV与CSFV的鉴别诊断有很好的应用价值,值得进一步开发。     

阿维菌素单克隆抗体的制备与鉴定

将与牛血清白蛋白(BSA)偶联的阿维菌素人工合成抗原AVM-BSA免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了2株分泌抗阿维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F2和2H10。生物学特性鉴定的结果表明,2株杂交瘤细胞株诱生腹水的效价为1∶6 400,分泌的抗体亚型均为IgM;间接竞争酶联免疫吸附试验结果表明,抗体的50%抑制质量浓度(IC50)为101 ng/mL,2株单克隆抗体与伊维菌素、多拉菌素、红霉素和白霉素均无交叉反应,证实单克隆抗体2H10具有很强的特异性,可用于阿维菌素药物残留免疫分析方法的建立。     

抗新城疫单克隆抗体的制备与特异性分析

以蔗糖反透析浓缩及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ 200层析纯化Ｆ48Ｅ8和ＬａＳｏｔａ新城疫病毒(ＮＤＶ),取纯化的病毒液免疫接种ＢＡＬＢ ｃ小鼠,将小鼠脾细胞与ＮＳ 1骨髓瘤细胞融合,经次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(ＨＡＴ)培养基选择,间接ＥＬＩＳＡ检测,有限稀释法克隆,筛选出了3株杂交瘤细胞,依次命名为1Ｄ4、1Ｄ5、16Ｇ12。3株杂交瘤细胞的染色体数为80～100,并能稳定传代,其产生的单克隆抗体重链属于ＩｇＧ1,轻链属于κ链;ＥＬＩＳＡ检测时仅与ＮＤＶ发生特异性反应,而与其他常见禽类病毒抗原不出现交叉反应,应用这些单克隆抗体对ＮＤＶ分离株进行了分群研究。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其应用

采用活病毒免疫,常规杂交瘤融合的方法,获得了4株针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/duck/Shandong/093/2004(A/D/SD/04)株血凝素(HA)的单克隆抗体A8E8、D2F8、A8C8和C3G4。其中A8E8可以与11株不同来源的H5N1AIV发生交叉免疫抑制性反应(HI),具有广谱性。采用间接免疫荧光试验(IFA),用A8E8单克隆抗体测定A/D/SD/04株对COS1和MDCK2种细胞的半数感染量(TCID50),结果显示,A/D/SD/04株在COS1上的TCID50为10-5.33/0.1mL,在MDCK上的为10-7.33/0.1mL。将编码A/D/SD/04株的HA基因质粒与PR8质粒共转染COS1细胞后,用A8E8进行IFA,能观察到特异性绿色荧光,这与鸡胚接种结果相符。表明,用此单克隆抗体能准确地检测到H5重组病毒。