牦牛胎儿成纤维细胞的分离培养

采用30d胚龄左右的牦牛胚胎,用2种不同的消化液消化后,将所得的牦牛胎儿成纤维细胞(yak embryonic fibroblasts,YEF)培养于不同血清含量的RPMI1640培养液中,并接种于2种不同材质的培养瓶表面,对YEF的分离方法、培养所需胎牛血清(FBS)添加量和不同基质表面对YEF生长的影响进行了研究。结果表明,含150 mL/L FBS的RPMI1640培养基最适合YEF生长,可传代27次以上;经用RPMI1640和D-Hank’s液配制的2．5 g／L胰蛋白酶消化,所得的YEF的细胞活率差异不显著(P>0．05),其原代细胞在含100 mL／L胎牛血清的RPMI1640培养液中的贴壁率差异极显著(P<0．01);不同生长基质对YEF的形态没有显著影响。     

牦牛子宫内膜细胞的分离培养及性激素对其增殖的影响

为了分离培养牦牛子宫内膜细胞,并探讨不同浓度雌激素和孕激素对上皮细胞和基质细胞增殖的影响,采用Ⅰ型胶原酶消化、离心分离和差速消化纯化的方法分离纯化上皮细胞和基质细胞,对其进行免疫细胞化学染色鉴定,绘制生长曲线,最后用MTT法测定不同浓度的17β-雌二醇和孕酮对细胞增殖的影响。结果显示,1g/L胶原酶消化1h,500r/min离心10min,经2代差速消化纯化获得的上皮细胞的纯度为96%,基质细胞的纯度为93%;不同浓度的17β-雌二醇均能促进上皮细胞和基质细胞的增殖,孕酮可促进基质细胞的增殖,但对上皮细胞的增殖有抑制作用,不同浓度的17β-雌二醇和孕酮共同作用均能显著促进基质细胞增殖,而对上皮细胞增殖的影响随混合液中孕酮浓度的增加由促进转为抑制。本研究获得了高纯度的牦牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞,证实雌激素能促进2种细胞的增殖,孕激素能促进基质细胞的增殖但抑制上皮细胞的增殖。     

牦牛子宫及卵巢动脉的铸型研究

为研究牦牛子宫及卵巢动脉的结构特点及供血特征,本文利用丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)血管铸型技术,对20例未发情的健康成年牦牛子宫及卵巢动脉进行离体铸型标本制作和观察.结果发现,牦牛的子宫动脉非常丰富,分为上行支和下行支.上行支在子宫角部发出卵巢支和输卵管支,与卵巢动脉吻合;下行支主要向子宫体和子宫颈供血,并且两侧子...     

CBS和CSE在成年牦牛子宫中的表达及定位

胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)通过与胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)共同作用生成内源性硫化氢(H₂S),参与硫氨基酸代谢来调控细胞的生长、增殖、凋亡等正常生理功能。为了解CBS和CSE在成年牦牛子宫中的作用,分别采集妊娠期、黄体期、卵泡期牦牛子宫组织样品,通过qRT-PCR、Western-blot和免疫组织化学等方法检测CBS和CSE基因及其蛋白的相对表达情况。结果显示,CBS mRNA在黄体期牦牛子宫组织中表达量显著高于妊娠期和卵泡期(P<0.05),且妊娠期的表达量显著高于卵泡期(P<0.05);CSE mRNA在妊娠期的表达量最高(P<0.05),黄体期和卵泡期的表达差异性不显著(P>0.05)。CBS蛋白在卵泡期的表达量最高(P<0.05),黄体期和妊娠期的表达差异量不显著(P>0.05);CSE蛋白在卵泡期牦牛子宫组织中表达量显著高于妊娠期和黄体期(P<0.05),且黄体期的表达量显著高于妊娠期(P<0.05)。免疫组织化...     

乳酸菌对子宫内膜上皮细胞的黏附及其对致病菌的拮抗作用

以永生化山羊子宫内膜上皮细胞作为体外模型,采用革兰氏染色法观察乳酸菌和致病菌对子宫内膜上皮细胞的黏附特性;通过平板计数法观察乳酸菌对致病菌的黏附拮抗作用.结果显示,嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、盲肠肠球菌对子宫内膜上皮细胞均表现出很强的黏附特性,黏附细菌数分别为每个细胞87、45、34个.黏附拮抗试验显示,3株乳酸菌均使致病菌...     

妊娠期牦牛输卵管的组织结构观察

采用组织学和组织化学方法对妊娠期牦牛输卵管的组织结构进行了观察.结果显示,牦牛输卵管壁具有3层结构,分别为黏膜、肌层和外膜.黏膜上皮主要由纤毛细胞、分泌细胞及少量基细胞和栓细胞组成.妊娠期牦牛输卵管漏斗部和壶腹部分泌细胞顶部有突起,漏斗部分泌细胞的突起呈现2种类型:一种突起中不含核,细胞胞浆的核上区和突起中可见过碘酸雪夫氏(periodic acid Schiff,PAS)反应阳性颗粒;另一种突起中含核,但无PAS反应阳性颗粒.壶腹部分泌细胞的突起均属第一种类型,峡部分泌细胞顶部无突起.固有层由疏松结缔组织构成,峡部固有层中含有浆液性腺.黏膜形成纵行的初级皱襞.漏斗部和壶腹部皱襞高而窄,分支多;峡部皱襞矮而宽,分支少.肌层主要由环形肌组成,从漏斗部向后,肌层逐渐增厚,峡部达到最厚.外膜为浆膜,在输卵管系膜处为结缔组织.     

牦牛FGF18基因的克隆及其在子宫中表达水平的检测

为研究牦牛FGF18(fibroblast growth factor 18)基因的序列特性及其在子宫中的表达水平,根据黄牛FGF18基因序列5′端和3′端的保守性设计特异性引物,RT-PCR扩增之后通过基因克隆得到牦牛FGF18基因,利用生物学软件对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测了FGF18基因在妊娠早期和非妊娠期牦牛子宫中的表达情况。结果显示,牦牛FGF18基因序列编码区长624bp,编码207个氨基酸,其中赖氨酸含量最高,约为9.7%;同源性分析和系统进化树显示,它与黄牛FGF18基因的同源性最高,为99.7%,表明FGF18基因在进化中具有高度保守性;编码产物的主要功能是胁迫应答和信号转导,与IL-1有相似的结构域,并且含有典型信号肽,整体表现为亲水性。QRT-PCR检测结果显示,FGF18基因在妊娠早期牦牛子宫中的表达量是非妊娠期子宫中表达量的24.7倍,说明FGF18蛋白在牦牛胚胎的早期发育中起着重要作用。     

牦牛莱姆病血清流行病学的初步调查

1991年5～12月,在甘肃省肃南县从不同生态环境下放牧的牦牛群采血清99份,用ELISA检测莱姆病流行情况,其中采自草甸草原牦牛群血清58份,检出阳性血清38份,阳性率为65.52％;采自灌丛草原牦牛群血清41份,检出阳性32份,阳性率为78.05％。总阳性率达70.71％(70/99)。     

伊氏锥虫体外培养的研究

用鼠体继代的水牛伊氏锥虫进行体外培养。经试验证实,以RPMI_(1640)加入20mmolHEPES、2mmol L-谷氨酰胺、2mmol L-苏氨酸、1.5mg/mlD-葡萄糖、0.5％水解乳蛋白(LH)及10％灭活犊牛血清组成的CM_3培养基,并以牛睾丸原代细胞为饲养层细胞效果最好,在37℃下可较好地支持伊氏锥虫的生长,接种虫体起始浓度为10~5/ml左右,可于第2天增至10~6/ml,并可维持该浓度达5天之久,从第6天开始,虫体逐渐减少,虫体可在该系统中存活14天,将培养12天的培养物接种小鼠,对小鼠致病性不变,同时还测定了HEPES、D-葡萄糖、培养不同时间的细胞单层、虫体不同接种浓度等对锥虫体外培养的影响。     

成年牦牛肺动脉的显微结构观察

通过HE和Verhoeffe's Van Gession染色法观察了成年牦牛肺动脉的组织结构,并用Image-Pro Express软件测算肺动脉中膜肌层的厚度,分析了肺动脉结构特性与高原低氧适应性的关系.结果表明,肺动脉的血管分支多数内、外弹性膜清楚;中膜和外膜的结构因管径不同而有差异,管径较大的血管中膜平滑肌和弹性纤维分布较多,外膜胶原纤维含量多,管径较小的血管中膜平滑肌和弹性纤维分布较少,外膜胶原纤维含量较少.肺动脉平滑肌含量丰富,直径17μm的血管中仍有平滑肌.肺动脉的性质多为肌性动脉和弹性动脉,伴行的多为终末细支气管以上的分支.肺动脉中膜肌层占血管外径的百分率(MT)变化幅度很大(1.89%～39.47%),其平均值为12.66%.证实成年牦牛的肺动脉富含平滑肌,即平滑肌相对增生变厚,低氧环境对牦牛肺有影响,肺动脉中膜肌层的少量增厚是对低氧的一种适应性结构.     

不同体外培养条件对家兔早期囊胚贴壁行为的影响

采集家兔自然交配后96 h的早期囊胚,以低糖DMEM 150 mL／L胎牛血清 0．1 mmoI／L非必需氨基酸 100 IU／mL青霉素 100 IU／mL链霉素为基础培养基,比较了不同胚胎处理方法、不同饲养层以及培养液中添加不同成分对兔早期囊胚贴壁和增殖的影响,以完善免胚胎干细胞的建系方法。结果表明,以胚胎分割法和链霉蛋白酶-E(proteinase E)处理掉黏蛋白及部分透明带的胚胎容易贴壁和增殖;在小鼠成纤维细胞饲养层和兔胎儿成纤维细胞饲养层上,胚胎的脱带率差别不大,但在小鼠成纤维细胞饲养层上贴壁率明显提高,且贴壁后内细胞团增殖较快;添加胰岛素、白血病抑制因子和β-巯基乙醇均利于抑制ES的分化和促进内细胞团的增殖。     

成年牦牛感染扩展莫尼茨绦虫的局部免疫细胞学反应

为明确扩展莫尼茨绦虫感染成年牦牛所引起的免疫细胞学反应及致病作用,对感染牛的寄生部位进行了观察与研究,并同正常成年牦牛进行了比较.结果表明,扩展莫尼茨绦虫成虫仅寄生于牦牛的小肠.寄生部位的黏膜可见少量出血点,表面附有较多黏液,散在直径2～3 mm的溃疡灶,小肠黏膜集合淋巴小结较对照组发达,数量明显增多.光镜下可见小肠黏膜出血,部分黏膜上皮坏死、脱落,局部黏膜相关淋巴组织增生明显,黏膜层嗜酸性粒细胞大量浸润,浆细胞、杯状细胞和嗜银细胞显著增生,黏膜下层血管周围肥大细胞增多.非寄生部位的组织及器官无明显病变.扫描电镜结果显示寄生部位的肠绒毛断裂或脱落,圆顶区的数量较对照组多,圆顶区滤泡相关上皮中M细胞的数量也较对照组多.研究证实,扩展莫尼茨绦虫感染可引起成年牦牛感染部位强烈的免疫细胞学反应,表明成年牦牛肠道黏膜的抗感染能力较强,故寄生虫对其致病作用较弱.     

微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型的建立及不同阶段虫体形态的观察

利用人回盲肠癌(HCT-8)细胞作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养,观察细胞的生长状况;在培养细胞中加入1×105个经活力检测的微小隐孢子虫卵囊,培养72h后用荧光标记的隐孢子虫卵囊、子孢子染色试剂盒Crypt-a-Glo和Sporo-Glo进行染色,观察不同发育阶段的隐孢子虫形态。结果显示,在六孔培养板中接种10×105个细胞后,24h后长成80%～100%单细胞层,可以用来接种微小隐孢子虫。培养72h后观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。结果表明,成功建立了微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型。     

单克隆抗体鉴定的鸡T细胞体内功能特性试验

对鸡Ｔ细胞特异性单克隆抗体１Ｂ６鉴定的Ｔ细胞亚群进行了体内功能试验，表明１Ｂ６＋Ｔ细胞缺陷鸡接种新城疫ＬａＳｏｔａ疫苗后，抗体效价明显降低，证明１Ｂ６＋Ｔ细胞具有辅助Ｂ细胞产生抗体的重要功能。     

山羊背根神经节神经细胞的原代培养及鉴定

从胎龄3个月左右的山羊胚胎中分离出背根神经节,采用组织块培养法,利用血清培养和无血清培养,并在非神经细胞抑制剂作用的条件下,观察了山羊背根神经节神经细胞在体外的生长状况,采用免疫荧光和RT-PCR技术对神经细胞表面标志神经元特异性磷酸化酶(NSE)进行了鉴定。结果显示,接种48h后的细胞从组织中迁出,并长出突起,经阿糖胞苷作用后,神经细胞与非神经细胞分层;经免疫荧光鉴定,上层细胞为神经细胞。随着时间的增加,神经细胞突起延长并交错成网状,至第6～10天神经细胞形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经细胞最长可生存32d。表明本试验成功分离培养得到了山羊背根神经节神经细胞。     

受精液和受精时间对牦牛卵泡卵母细胞体外受精的影响

利用屠宰牦牛卵巢,抽取其表面2~5 mm的卵泡内卵母细胞,经体外成熟后分别用BO液和改良Tyrode’s液进行体外受精研究。结果表明,BO液受精6 h和改良Tyrode’s液分别受精6 h和18 h,牦牛体外受精卵的卵裂率差异不显著(分别为52.48%、47.67%和50.00%,P>0.05)。它们的4细胞发育率分别为75.47%、78.05%和64.10%,8细胞发育率分别为56.60%、56.10%和48.72%,使用改良Tyrode’s液受精18 h的发育率最低,与其他2组相比,差异极显著(P<0.01);而受精时间同为6 h时,2种受精液之间发育率的差异不显著(P>0.05)。     

山羊成骨细胞的体外培养和鉴定

采用初生山羊羔股骨骨膜,通过植块培养法、完全消化法和半消化植块法分离、培养成骨细胞。结果表明,植块培养法、完全消化法和半消化植块培养法的贴壁时间分别为4、24、4 h;培养4 d时的细胞数量分别为少量细胞、少量细胞、大量细胞,细胞汇合时间分别为21、19、10 d。传代后第7 d即可汇合,第14 d出现矿化结节,茜素红染色呈橘红色,Von Kossa染色呈黑色;姬姆萨和HE染色后可见体外培养的细胞呈三角形、多角形,胞质丰富,胞核卵圆形,单核,有1~3 个核仁;碱性磷酸酶染色后胞质呈黑色颗粒或块状沉淀;扫描电镜观察胞突发达,伸出的突起与临近细胞的突起相连。体外培养传至15代时细胞的生物学性状未发生变化。试验结果显示,半消化植块培养周期短,细胞损害小,有利于细胞贴壁,是一种可行的骨组织工程研究方法。