鸭疫里氏杆菌敏感烈性噬菌体的分离鉴定

为探索鸭疫里氏杆菌病的生物疗法,以富集法对健康番鸭的粪便进行了分离,获得1株鸭疫里氏杆菌敏感的烈性噬菌体,命名为RAP15.该噬菌体能裂解2株鸭疫里氏杆菌(RAf63和RAf71),说明噬菌谱较窄.透射电镜观察结果显示,该噬菌体由呈多面体的头部(直径约55 nm)和细长的尾部(长约200 nm)组成.RAP15的基因组可以被DNase Ⅰ消化,但不能被RNase A和绿豆核酸酶消化,提示其核酸类型为双股DNA.形态学和分子特征提示,RAP15属于长尾病毒科.     

鸭疫里氏杆菌病灭活疫苗的研制

从河北省某肉鸭场的鸭疫里氏杆菌病发病鸭中分离出鸭疫里氏杆菌 (Riemerellaa natipestifer ,RA)菌株。对该菌株采用液体、固体两种方法增菌培养后制成油乳剂灭活疫苗 ,以 0 .5mL/只剂量经皮下免疫 7日龄雏鸭 ,并在河北省某发病肉鸭场进行了田间试验 ,表明该疫苗免疫效果良好 ,保护率达 90 %以上     

人工感染鸭疫里氏杆菌雏鸭的病理学变化

用鸭疫里氏杆菌 (Riemerellaanatipestifer)人工感染 7日龄雏鸭 ,对其进行了临床症状、病理剖检和病理组织学观察。试验结果表明 ,人工感染鸭疫里氏杆菌 2 4h后 ,感染鸭开始出现死亡 ,且在 4 8h内全部死亡。剖检可见典型的纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。病理组织学检查表明 ,在感染鸭的心、肝、脾、肺组织出现纤维素性炎症 ,脑和肾组织分别出现脑膜炎和坏死性肾炎等变化。     

血清5型鸭疫里氏杆菌在我国的发现及其病原特性研究

1994年 1月至 2 0 0 0年 10月 ,从全国 2 5个省、自治区、直辖市的 5～ 90日龄患典型鸭疫里氏杆菌病的种鸭和商品鸭中分离到 89株血清 5型鸭疫里氏杆菌。对其病原学特性研究结果表明 ,血清 5型鸭疫里氏杆菌病在我国鸭群感染范围极广 ;分离菌株对雏鸭具有很强的致病性 ,对小白鼠无致病性 ;各地分离菌株表现出一致的形态特征和非常相似的生理生化特性 ;各地分离菌株耐药谱很广 ,但对头孢类药物和利福平高度敏感。用分离菌株制备的灭活疫苗免疫雏鸭具有很好的免疫原性。     

鸭疫里氏杆菌病的病原学特性研究

20 0 1年 6月至 2 0 0 2年 4月 ,从浙江省 7个地、市患典型鸭疫里氏杆菌病的不同品种病死鸭分离到 2 0株鸭疫里氏杆菌 (RA) ,所分离菌株对各品种雏鸭具有很强的致病性 ,各分离菌株表现出一致的形态特征和非常相似的生理生化特性。     

广东省肇庆地区鸭疫里氏杆菌病的调查

在广东省水禽养殖较密集的肇庆地区选择4个鸭疫里氏杆菌病发病鸭场和1个未发病鸭场,采集病料,进行病原分离,并用玻片凝集试验和琼脂扩散试验检测分离株的血清型.结果表明,该地区流行的鸭疫里氏杆菌(RA)仍以1型为主,但有1株与RA 1型抗血清无交叉反应.对RA分离株进行8种抗生素的敏感性试验显示,分离株对丁胺卡那霉素极度敏感,对头孢唑啉、新霉素、头孢氨苄高度敏感,对氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星有不同程度的抗药性.     

鸭疫里氏杆菌病四价灭活疫苗的研究

在全国流行病学调查的基础上 ,选择四川等地流行广泛的鸭疫里氏杆菌 (RA) 1、2、4和5血清型菌株制备铝胶佐剂四价灭活疫苗。对疫苗经无菌检验及安全检验合格后 ,给 3日龄樱桃谷商品鸭每只颈背皮下注射 0 .5mL ,第 10、13和 16d免疫鸭对同源RA的攻击分别表现出 5 %～2 0 %、75 %～ 90 %和 10 0 %免疫保护力 ,第 2 3～ 30d免疫保护力开始下降。用间接ELISA对免疫鸭进行抗体消长规律检测 ,表明 3日龄樱桃谷鸭首免后第 2 3d抗体达到高峰 ,至 93日龄时仍能检出抗体 ;10日龄时进行二免后可产生更高的抗体水平 ,到第 65d时仍能保持较高抗体水平。疫苗免疫雏鸭能够显著 (P <0 .0 5 )或极显著 (P <0 .0 1)地增强其T细胞的免疫力 ,时间达 2周。经攻毒保护试验、抗体消长规律测定、T细胞免疫水平测定和田间试验 ,证明研制的鸭疫里氏杆菌病(RAI)四价灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性 ,能有效预防RAI的发生     

3型鸭疫里氏杆菌的分离与鉴定

采集福州市北郊某番鸭场接种过 1型和 2型鸭疫里氏杆菌 (RA)双价灭活疫苗而发病死亡的雏鸭肝 ,从中分离到 1株RA ,经对分离菌培养特性、形态观察和血清型鉴定 ,属 3型RA。     

鸭疫里氏杆菌不同血清型广西株的分离鉴定

从广西部分地区9个发病鸭场的病料中分离出9株疑似鸭疫里氏杆菌,经培养特性、形态、染色特性及生化反应特性等鉴定为鸭疫里氏杆菌(RA).RA血清型分型试验结果表明,9株分离菌中有7株(GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX8)属血清型Ⅰ型;另2株(GX7、GX9)与GX1株的阳性血清无交叉凝集反应,GX7、GX9株制备的阳性血清也无交叉凝集反应,表明这2株菌既非Ⅰ型又不属同型的RA.经致病性试验,GX1株具很强的致病力,能使北京鸭和本地麻鸭发病死亡;GX7和GX9株仅能使北京鸭发病死亡,而不致本地麻鸭发病.结果表明,广西存在着不同血清型的RA,而且有的菌株致病性很强.     

鸭疫里氏杆菌转座子随机突变库的构建

通过接合转导的方法构建鸭疫里氏杆菌Yb2和CH3株的Tn4351转座子突变库,以便筛选和鉴定鸭疫里氏杆菌的功能基因。先将携带质粒pEP4351(含Tn4351转座子序列)的大肠杆菌BW19851(pEP4351)作为供体,与受体菌鸭疫里氏杆菌强毒株Yb2或CH3株进行接合转导,使质粒pEP4351导入Yb2或CH3株细菌内,进而转座子Tn4351随机插入鸭疫里氏杆菌的基因组中,然后用含红霉素和卡那霉素的胰酶大豆琼脂平板进行阳性接合子的筛选。用PCR扩增鸭疫里氏杆菌16S rRNA基因和红霉素抗性基因EmF进行转座子插入突变株的鉴定,最终成功地构建了鸭疫里氏杆菌Yb2株和CH3株各包含3 100株和2 520株突变株的Tn4351转座子随机突变库,接合转导效率分别为1.7×10-6和3.9×10-6。转座子随机突变库的构建为下一步根据突变株表型的变异来筛选和鉴定鸭疫里氏杆菌的毒力相关等基因奠定了基础。     

鸭疫里氏杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测鸭疫里氏杆菌,以纯化的兔抗1型鸭疫里氏杆菌抗体作为捕获抗体,以纯化的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。最佳的方案为用184ng/孔纯化的多抗包被过夜,100mL/L小牛血清37℃封闭2h,检测抗原、单抗、酶标抗体均为37℃作用1h,显色20min后终止反应,D450nm值高于0.330且P/N>2.1判定为阳性。该方法特异性强,与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌无交叉反应,最低检测剂量为104 CFU/mL。与传统细菌分离方法相比,该方法的敏感性为100%,符合率为85.2%。本研究首次建立了检测鸭疫里氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法,且特异、敏感。     

鹅源2型鸭疫里氏杆菌的分离与鉴定

从剖检表现纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎的病死雏鹅脑内分离到 1株细菌 ,定名为G0 2 0 1B株 ,经形态学观察、生化试验及血清型鉴定 ,确定为 2型鸭疫里氏杆菌。经人工感染试验 ,表明该菌对雏鹅有极强的致病力 ,致死率高达 10 0 %。     

鸭疫里氏杆菌病三价油乳剂灭活疫苗的研究

以 1、2、10型鸭疫里氏杆菌 (RA)分离株为菌种 ,研制鸭疫里氏杆菌病三价油乳剂灭活疫苗。经无菌及安全检验合格后 ,对 6日龄樱桃谷雏鸭颈部皮下接种 0 .4mL/只 ,免疫后第 10、14、2 1和 3 5d分别用 1、2、10型RA强毒株攻击 ,第 14d的攻毒保护率为 91.7%～ 10 0 % ,3 5d的攻毒保护率为 66.6%～ 83 .3 %。田间试验结果表明 ,雏鸭 5～ 7日龄免疫后至上市保护率可达 95 .0 %～ 10 0 %。     

鸭疫里默氏杆菌16 S rRNA PCR快速检测方法的建立

根据GenBank中的鸭疫里默氏杆菌(RA)1～19型16 S rRNA基因序列,分别与大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的16 S rRNA基因序列对比,设计特异性引物,建立了基于鸭疫里默氏杆菌16 SrRNA的PCR检测方法.结果表明,用该方法对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌进行检测,只有鸭疫里默氏杆菌的DNA能扩增出680 bp的特异条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带;测序结果与GenBank中鸭疫里默氏杆菌相应序列完全一致;同时分别将鸭疫里默氏杆菌基因组DNA和菌液10倍稀释进行PCR扩增,对鸭疫里默氏杆菌DNA的最小检出量为1.907×10~(-5)g/L,对鸭疫里默氏杆菌菌液的最小检出量为1.5×10~4CFU/mL.证实,建立的基于鸭疫里默氏杆菌16 S rRNA的PCR检测方法具有快速、灵敏、特异的优点,可用于鸭疫里默氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定.     

鸭疫里氏杆菌鸭源致病性大肠埃希氏菌和鸭沙门菌的RAPD研究

以 4株不同血清型的鸭疫里氏杆菌、5株不同血清型的鸭源致病性大肠埃希氏菌和 5株同一血清型的鸭沙门菌为研究对象 ,分别提取基因组DNA ,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行了分析。结果 ,从 2 0条随机引物中筛选出了 38条能在这 3种菌中有较好多态性的随机引物 ,8个有效引物共扩增出了 10 2个DNA片段 ,其中 14个菌株共有的谱带仅有 1条 ,显示多态性的片段有 10 1个 ,占 99.0 % ;对RA的 4个菌株扩增出的谱带数为 5 1条 ,共同片段有 12条 ,多态性片段 39条 ,占 76 .5 % ;对沙门菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 6条 ,共同片段为13条 ,多态性片段 33条 ,占 71.7% ;对大肠埃希氏菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 8条 ,共同片段 4条 ,多态性片段 4 4条 ,占 91.7%。在 8条引物中进一步筛选出 1条引物G12 ,其图谱中 5 35bp的条带为鸭疫里氏杆菌所特有 ,330bp的条带为沙门菌所特有 ,12 2 7bp的条带为大肠埃希氏菌所特有 ,表明G12可作为分子标记用来鉴别这 3种细菌。     

鸭疫里氏杆菌地区流行株的分离与外膜蛋白A的变异性分析

2010年从安徽省和江苏省境内发病鸭的病理组织中分离到8株鸭疫里氏杆菌(RA),分别被命名为AH1、AH2、AH3、AH4、JS1、JS2、JS3、JS4,其中AH1、JS4为血清1型,AH2、AH3、AH4、JS1、JS2、JS3为血清2型。8株RA的菌体形态、生化特性、PCR鉴定结果相同,但致病力不同,AH1毒力最弱,对鸭的发病致死率仅为16.7%。序列分析结果显示,8株分离菌的外膜蛋白A(OmpA)基因的核苷酸序列同源性为96.9%～100%,氨基酸序列同源性为98.2%～100%。将8株RA与GenBank中登录的其他55株RA的OmpA进行变异性分析,结果其核苷酸序列同源性为89.6%～100%,氨基酸序列同源性为90.2%～100%。从系统发育进化树中可将这63株RA分为4个亚群,不同国家和地区的RA株在亚群中没有显示地域或时间特征,而是呈现出了互相交叉的现象,RA的OmpA差异与血清型、分离时间和分离地点没有必然的联系,本试验近期分离的8个RA株分布在2个亚群中。     

噬菌体在细菌性疾病诊断和治疗中的应用

从重组噬菌体法、生物扩增法、噬菌体触发的离子级联感应技术及耐药性检测4个方面阐述了噬菌体在病原菌检测中的作用;从细菌分型的角度阐述了噬菌体在病原菌分型中的应用;从活噬菌体、裂解酶、药物载体3个方面陈述了噬菌体在细菌性疾病治疗方法中的研究进展,并分析了噬菌体在应用中的优缺点,展望了今后的研究和应用前景。