核酸探针技术研究进展

为有效地控制和治疗疾 病,当前极需研究快速、可 靠、高度特异的诊断技术。因 通常使用的免疫学试验方法往往满足不了这些要求,不能可靠地区分两个紧密相关的种(或株);不能真实地说明动物当时的健康状况。随着科学技术和工业生产的发展,在今后的日子里,核酸探针、限制酶分析(REA),聚合酶链反该(PCR),单克隆抗体和ELISA等分子生物学诊断技术将会很快地走出科学家的实验室,成为广大的野外兽医和实验室工作人员诊断疾病的有力武器。在分子生物学技术里核酸探针技术是最有实用前景的     

地高辛标记核酸探针及其应用近况

地高辛标记核酸探针及其应用近况罗满林，李光富，蔡宝祥，陈溥言（南京农业大学２１００９５）核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆，检测感染性疾病的致病因子和诊断遗传病。最早使用的放射性同位素标记核酸探针，具有敏感性高，特异性好和分辨力强的特点，故沿用至今。但...     

用光生物素标记核酸探针的研究

用放射性同位素标记核酸目前还只局限在一些有条件的实验室进行。另外,放射性标记探针还有保存时间短,危害人身安全等缺点。 本文介绍用光生物素标记核酸探针的方法,它既保留了生物素标记的优点,而且比应用放射性同位素方便安全。它不用缺口翻译方法进行标记,只用可见光照射即可标记成核酸探针,不管是DNA、RNA,还是单链双链皆可进行标记。这样核酸探针标记技术被进一步简化,使其更有利于临床应用。     

生物素标记核酸探针的应用概况

目前,基因探针已用于人和家畜传染病、寄生虫病的诊断及流行病学的调查。它具有高度的敏感性,并且基因探针的检测是建立在探针和待检基因序列同源性的基础上,因此具有高度的特异性。基因探针采用的标记方法有同位素标记、生物素标记和化学修饰核酸标记。但在这之前,用得较多的仍然是同位素标记的核酸探针。然而,由于放射性同位素的应用存在着不够安全方便、实验周期长、半衰期短、价格昂贵以及污染等缺点,使分子杂交技术的推广应用受到一定程度的局限。为此,各国研究工作者一直在探讨一种非放射性的核酸标记方法。近年出现的生物素标记的核酸探针技术就是这方面的一大突破,此种生物素化的脱氧尿嘧啶苷,     

核酸探针应用中存在的问题与解决对策

核酸探针作为诊断试剂已应用于人和家畜传染病、寄生虫病及遗传性疾病的临床检测和流行病学的调查。但由于存在特异性和敏感性等问题,限制了进一步在临床医学和临床兽医学上的推广。本文就当前的核酸探针做为诊断试剂在应用中存在的问题做一简述和分析,并介绍几种解决这些问题的新技术。     

国产与进口光生物素标记核酸探针的比较

我们用澳大利亚Bresatic公司生产的光生物素与国内两家(称甲所和乙所)研制的光生物素进行标记核酸探针作了比较试验。 探针标记 在3个硅化玻璃管中,分别加入5μ1λDNA(0.5μg/μl),于暗室中再分别加入5.5μl光生物素(国产与进口的浓度均为1mg/ml),放在冰浴上,200w汞灯照射25分钟。然后加入100μl 0.1mol TE(0.1mol Tris/HCl pH9.0,1mmol EDTA),用仲丁醇抽提两次,下层水相的体积约剩45μl,再加入22.5μl 7.5molNH_4AC,20.1μl冷无水乙醇,-20℃过夜,15000r/min离心,抽干,分别溶于27.5μl TE中。     

地高辛核酸探针用于马立克氏病病毒分型鉴定

地高辛核酸探针用于马立克氏病病毒分型鉴定李光富，陈溥言，蔡宝祥，张林元，邓小昭，刁振宇（南京军区军事医学研究所２１０００２）马立克氏病毒（ＭＤＶ）不同毒株在毒力和产生组织病变方面有明显差异。最早是英国的Ｂｉｇｇｓ根据ＭＤＶ对鸡的致病和致瘤特性将的ＤＶ...     

光生物素标记核酸探针检测水貂肠炎病毒的研究

水貂肠炎病毒(MEV)的检测,目前主要采用病毒分离和血清学方法。为了能直接从样品中检测病毒,我们于1988年秋冬,首次采用了光生物素标记核酸探针打点杂交的方法,结果证明这种方法效果良好,能特异地检出MEV,且灵敏度高,可检测出10pg水平的病毒DNA。     

鸭瘟病毒基因组核酸的制备

用鸭瘟病毒国内标准株DPV34F2接种 10～ 12日龄的非免疫鸭胚 ,37℃培养 5d后 ,收获清亮尿囊液 ,采用高速离心结合切向超滤的方法浓缩纯化含毒尿囊液。然后通过改进的酚∶氯仿抽提法提取其中的病毒基因组核酸 ,用 4对特异引物对抽提物进行PCR鉴定。结果表明 ,应用上述方法可以获得较完整的鸭瘟病毒基因组核酸     

用生物素标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究

将纯化的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)全基因组用缺口翻译方法把生物素—尿苷三磷酸(Biotin-dUTP)掺入双链IBRV—DNA上作为探针,与点在硝酸纤维膜上的样品进行打点杂交,然后在链霉亲合素—碱性磷酸酶中孵育,用氮蓝四唑和5—溴—4—氯—3—吲哚磷酸作用,阳性反应呈现紫色斑点。通过检测样品中IBRV—DNA同源序列,以确定是否存在IBRV。结果表明,应用生物素核酸探针可检出10pg的IBRV—DNA,具有灵敏、快速、无放射性污染、探针保存时间长等优点,为IBRV临床检测提供了一个有力的手段。     

蓝舌病毒核酸末端标记方法的研究

应用[γ—~(23)P]ATP对蓝舌病毒核酸进行末端标记,结果表明3’末端标记制备的探针的放射比强度明显高于5’末端标记,而5’末端脱磷后再标记的结果同样较为理想。应用3’末端标记法或5’末端标记法皆能获得高放射比强度的核酸探针,完全满足于核酸试验。     

用聚合酶链反应及核酸探针从新城疫病鸡体内检出传染性法氏囊病病毒

用鸡传染性法氏党病病毒（ＩＢＤＶ）逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和地高辛（ＤＩＧ）标记的ｃＤＮＡ探针组织印迹杂交试验，从某鸡场爆发新城疫（ＮＤ）的病鸡脾及法氏囊组织中检测到了ＩＢＤＶ，证明该ＮＤ病鸡存在ＩＢＤＶ的亚临床鸡鸡感染。进而分析了该疫情的爆发原因，并对鸡传染性法氏囊病的亚临床型感染和免疫程序进行了研究。     

反义核酸及反义核酸技术

反义核酸及反义核酸技术韩雪清（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）反义核酸以其独特的方式“特异性封闭”来调节和控制基因乃至许多生命现象，得到了生物界的高度重视。８０年代发展起来的反义核酸技术以其全新的思路和分子遗传学手段成为一门最新兴的生命科学...     

禽类采血方法简介

心脏采血法 ①侧位采血法:将禽侧位固定在工作台上,翻开左翼以充分暴露左胸部,以指触摸,寻找第2和第3肋骨,第3肋骨胸骨部前方及第2肋骨端腹侧区域即为心脏区域。该区域用碘酒、酒精棉消毒,用18号注射针直刺入心脏。注意不要刺入过深、过猛,避免刺透心脏。②仰位采血法:由助手或采血者把禽胸侧向上固定,在腹侧正     

黄曲霉毒素检测方法简介

黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一种强烈致癌性物质。目前已鉴定出13种,分为两大类——B_1及其衍生物和G_1及其衍生物。B_1的衍生物包括B_2、B_2a、M_1、M_2、P_1、Q_1、四氢脱氧B_1和黄曲霉毒素醇;G_1的衍生物包括G_2、G_2a和GM_1。食品与饲料中污染的A-FT主要有B_1、B_2、G_1、G_2、M_1和M_2。由于AFT的毒性大、污染广且难以去毒,对人们的健康危害很大,因此对AFT的监测显得十分重要。自60年代初以来,建立的检测AFT的方法已达30余种,这些方法可归成三大类,即生物学方法、化学方法和免疫学方法。(一)生物学方法 有10种,主要用于定性。     

胶体金探针——免疫金、免疫金银染色方法

(一)胶体金的制备方法 胶体金多用还原法来制备。常用的还原剂有白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等。常用的还原法有以下几种: 1.白磷还原法(Zsigmondy 1905年):取0.01％氯金酸水溶液100ml,以0.2mol碳酸钾调节其pH7.2,加热煮沸。在刚开始沸腾时,迅速加入0.5ml白磷的饱和乙醚溶液,振摇混匀,直至溶液呈现橙红色时即可。此法制得的胶体金颗粒大小较均匀一致,直径为3nm左右,既适宜于细胞内外抗原成分的标记,又能用于病毒     

鸡新城疫疫苗饮水免疫方法简介

疫苗免疫的方法很多,常见的有滴鼻、点眼、皮下或肌肉注射、刺种,气雾和饮水等。群体免疫以饮水法较为实用,而气雾法因受条件限制,往往不如饮水法方便。饮水免疫省时、省力、操作简便,已用于鸡新城疫(ND)、传染性支气管炎(IB)和传染性法氏囊病(IBD)等。本文仅就新城疫Ⅳ系(Lasota)疫苗的饮水免疫方法及应用作以简述。 (一)效果观察 1.笔者对青岛市某鸡场饲养的2639只海赛克斯祖代雏鸡应用NDⅣ系疫苗进行了饮水免疫。10日龄首免时,用Ⅳ系滴鼻和灭活苗半个剂量注射,免疫后15～20天采血测HI抗体,48日龄时HI效价均值为6.0log_2,至71日龄时HI抗体效价降至3.92log_2。于75日龄时进行Ⅳ系疫苗(弱毒)饮水免疫,免疫前停水4小时。疫苗用量为1.5剂量/只,用凉开水稀释,加水量按每1000 只鸡40L计算,并加0.2％脱脂乳。将疫苗水直接加入塑料水槽中让鸡自饮,在20分钟内喝完。     

常用兽医针治方法简介

兽医针炙术治疗畜禽疾病,具有治疗范围广,疗效迅速,操作简便,经济实用等特点,深受广大群众欢迎。现将最常用的四种传统针治方法,介绍如后。 (一)圆利针治疗 圆利针又名白针,《元亨疗马集》记载“拽皮泄湿气,白针弓子穴”即指此种针法。近年来有些兽医用毫针代替圆利针,但圆利针有进针快、不易弯折、针孔愈合快、适于留针、刺激量大,疗效高等优点,所以仍为多数临床兽医应用。 1.针法:应用圆利针治疗,一般病畜不需特     

牛病毒性腹泻病毒三种核酸检测方法的比较

利用针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的常规RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)和RT-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)3种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行了检测,以比较3种核酸检测方法的优越性。结果显示,3种核酸检测方法中,real-time RT-PCR和RT-LAMP一样敏感,均能检测到10拷贝/μL,常规RT-PCR只能检测到1×104拷贝/μL,但临床样品检测表明,常规RT-PCR方法敏感度低,会造成一部分漏检,RT-LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较3种方法后,推荐用RT-LAMP结合real-time RT-PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛病毒性腹泻的检出率。     

核酸未来的疫苗

核酸未来的疫苗靳家声（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）核酸将会成为第三代疫苗而被使用。第一代和第二代疫苗是根据获得抗原材料的两种技术来划分的。第一代疫苗采用的技术是获得活的致弱的生物体，或者杀死的整个生物体；第二代疫苗采用了另一种技术，通过...