猪布氏菌病血清学非特异性因素研究

据国内外文献报道,布氏菌与其它许多菌呈现血清学交叉反应,如土拉仑菌、埃希氏大肠杆菌(0:157)、沙门氏菌(N群)、霍乱弧菌、假单胞菌、小肠结肠炎耶尔辛氏菌0:9(简称Y.e.0:9菌)血清型。其中Y.e.0:9菌与布氏菌的血清学交叉反应最为明显。一般认为,在布氏菌病血清学诊断中,Y.e.0:9菌是引起布氏菌病诊断混乱的最     

鸡源沙门菌噬菌体的生物学特性及其对雏鸡肠道结构的影响

为了评价沙门菌噬菌体SJT-90用于防控沙门菌病的效果,利用双层平板法从蛋鸡养殖场污水中分离并纯化1株沙门菌噬菌体SJT-90,观察噬菌斑形态,利用透射电镜观察SJT-90的超微结构,同时对SJT-90的MOI、一步生长曲线、热稳定性、酸碱稳定性以及裂菌谱等生物学参数进行了测定,使用BLAST和VFDB数据库进行比对,...     

沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的研究

以1株肠炎沙门菌(CICC21482)为宿主菌,从湖北省某规模化养猪场的污水中分离得到1株烈性沙门菌噬菌体,命名为SP01,并对其生物学特性进行了初步研究。采用双层平板法筛选并纯化噬菌体,观察噬菌斑的形态;采用透射电镜观察SP01颗粒;酚-氯仿法提取SP01核酸,酶切分析其核酸类型。同时对噬菌体SP01的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)、一步生长曲线、热稳定性、p H稳定性、噬菌体SP01对细菌的裂解曲线及裂解谱等生物学特性进行了研究。结果,噬菌体SP01噬菌斑形态呈圆形、透亮,边界清晰,无晕环,直径约为1~2 mm;电镜下可见噬菌体SP01有一正多面体立体对称头部,直径约63 nm,含非收缩性尾部,尾长约158 nm,为长尾科噬菌体;提取基因组,酶切鉴定该噬菌体核酸类型为双链DNA;当MOI=0.1时,子代噬菌体滴度较高;噬菌体SP01除对本身宿主菌产生裂解外,还裂解猪霍乱沙门菌和都柏林沙门菌;一步生长曲线试验结果显示,其感染宿主菌的潜伏期约为20 min,裂解期约为60 min,平均裂解量约为120 PFU/cell;噬菌体SP01在20~40℃稳定,在p H=4.0~11.0稳定;对体外培养的特定血清型的沙门菌具有良好的裂菌效果。上述结果表明,噬菌体SP01为1株沙门菌烈性噬菌体,对不同温度、p H的环境均有较强的适应能力且杀菌能力较强,具有开发为抗沙门菌制剂的潜力。     

一株奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的研究

本研究旨在分离鉴定奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌噬菌体,并研究其生物学特性。利用双层琼脂噬菌斑法从生活污水中分离金黄色葡萄球菌噬菌体;通过核酸酶处理分析核酸类型;采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小;同时测定其最佳感染复数、一步生长曲线和裂解谱。结果显示,本研究分离到1株烈性金黄色葡萄球菌dsDNA噬菌体,命名为噬菌体SAGD1。该噬菌体头部呈二十面体,直径约98nm,有一带伸缩尾鞘的长尾,大小约14nm×200nm,属于肌尾噬菌体科。该噬菌体的最佳感染复数为0.01;感染宿主菌潜伏期约20min,裂解期约30min,裂解量为80。且该噬菌体能裂解1株表皮葡萄球菌及35株金黄色葡萄球菌。结果表明,本研究分离的烈性噬菌体具有金黄色葡萄球菌生物抑菌剂的应用潜力。     

产志贺毒素大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_PHB05的生物学特性及全基因组分析

产志贺毒素大肠杆菌又称产Vero细胞毒素大肠杆菌,是一种可引起水样腹泻、溶血性尿毒综合征、出血性结肠炎等的人兽共患肠道致病菌。以一株产志贺毒素大肠杆菌为宿主菌,从湖北某规模化养猪场的污水中分离得到一株烈性产志贺毒素大肠杆菌噬菌体,命名为v B_Eco M_PHB05。采用双层平板法筛选并纯化得到一株噬菌体,采用透射电镜观察噬菌体颗粒;使用Ion Torrent测序平台进行噬菌体全基因组测序,同时对噬菌体最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线、裂解谱等生物学特性进行研究。结果表明,噬菌体v B_Eco M_PHB05在电镜下可见有一正多面体立体对称头部(直径约72 nm),含收缩性尾部(尾长约45 nm,尾宽20 nm),为肌尾科噬菌体;提取基因组,酶切鉴定该噬菌体核酸类型为双链DNA;其最佳感染复数为0.1;一步生长曲线试验结果显示,噬菌体v B_Eco M_PHB05潜伏期约为20 min,平均裂解量约58 PFU/cell;基因测序结果表明,该噬菌体全基因组全长147 659 bp,G+C含量37.5%。噬菌体v B_Eco M_PHB05除对本身宿主菌产志贺毒素大肠杆菌(Escherichia coli O34)产生裂解外,还裂解其它产志贺毒素大肠杆菌和沙门菌。噬菌体v B_Eco M_PHB05为一株广谱烈性噬菌体,其基因组中不含耐药基因及毒力基因,具有开发为抗产志贺毒素大肠杆菌制剂的潜力。     

一株铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究

为控制铜绿假单胞菌的感染或污染提供生物制剂,分离到1株新的铜绿假单胞菌噬菌体,并研究其生物学特性。以铜绿假单胞菌为宿主细菌,从山西太谷某养鸡场的污水粪便混合物中分离出噬菌体。采用双层琼脂法对该噬菌体进行了分离和表征鉴定,用透射电镜（TEM）观察噬菌体的形态和大小,同时测定了噬菌体滴度、感染复数（MOI）、体外抑菌活性、一步生长曲线、温度、pH和氯仿稳定性。提取分离的噬菌体DNA,通过测序方法进行序列分析。结果显示,本研究分离出1株铜绿假单胞菌的烈性噬菌体,透射电镜显示该噬菌体属于肌病毒科,命名为v B＿PaeM＿TG2。噬菌斑大小为1～2 mm,最佳MOI为0.1,潜伏期约为10 min,暴发期约为30 min。v B＿PaeM＿TG2对温度、氯仿和pH具有良好的耐受性。v B＿PaeM＿TG2是双链环状DNA,基因组大小为206 910 bp,平均GC含量为62.07%,预测有387个开放阅读框。结果表明,分离的铜绿假单胞菌噬菌体v B＿PaeM＿TG2潜伏期较短,裂解能力强,在高温、高氯仿浓度和宽pH范围下比较稳定。本研究为铜绿假单胞杆菌病的防治提供了新的理论支持。     

绵羊肠耶新氏菌在体内的分布及其内毒素所致病理变化

本文研究观察了在SLB 090-1株Y·e活菌液以不同 途径人工感染后,以及该菌内 毒素和经化学处理菌液接种动物后,它们所致病理变化和体内菌分布。 (一)材料与方法 1.菌株:系本研究组分离自某牧场自然患病羊的生物3型(NB_3)绵羊肠耶新氏菌,菌株代号SLB 090-1。菌种保存于血清马丁琼脂斜面,使用前经羊体传代3代。SLB 090-1株菌对兔、羊的最小致死量(MLD)分别为2亿活菌和10亿活菌(限于条件未作进一步稀释求出LD_(50))。将计量的SLB090-1菌株菌液分为3份,一份作活菌(RD)接     

展呈H5N1亚型禽流感病毒M2e表位鞭毛蛋白的构建及其免疫原性

以重组质粒pET-fliC和pUC57-M2e2为模板,通过重叠PCR将M2e2基因插入fliC的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/M2e2。将fliC/M2e2片段插入原核表达载体pET30a+,获得重组质粒pET-fliC/M2e2,将其转化鼠伤寒沙门氏菌LB5000,获得重组菌LB5000(fliC/M2e2)。应用P22噬菌体转导技术,将fliC/M2e2基因导入都柏林沙门氏菌SL5928的基因组中,经生化血清学鉴定、动力学测定、透射电镜观察、Western-blot分析,将阳性转导菌命名为SL5928(fliC/M2e2)。提取重组菌鞭毛蛋白fliC/M2e2作用HEK293-mTLR5细胞,能刺激细胞分泌IL-8。将fliC/M2e2通过皮下注射途径免疫C3H/HeJ小鼠,50μg/只。结果显示,二免后第14天,fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫组的血清抗体效价与对照组之间呈现显著性差异(P<0.05)。ELISPOT结果表明,在脾细胞中,fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫组检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,且免疫应答以Th1型为主。结果表明,构建的fliC/M2e2嵌合基因能够在沙门氏菌中表达,重组嵌合鞭毛蛋白fliC/M2e2能激发机体针对M2e表位的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答。     

从病死猪肺中检出1株有致病力的放线杆菌

从1例由猪链球菌Ⅱ型引起的人、猪共患传染性疾病病死猪肺中,同时分离出1株液化明胶的猪放线杆菌.经动物试验证明,该菌亦具有一定的毒力,在猪的混合感染试验中使猪死亡加速,椎测该菌在此次猪的疾病发生过程中起协同作用.     

应用λgt11载体系统克隆与表达禽源巴氏杆菌的抗原蛋白基因

本研究应用λgt11载体系统构建了禽源巴氏杆菌P1059菌株DNA的表达型基因文库。P1059DNA被机械剪切刀随机剪切成2～8kb大小的片段,其内部EcoRⅠ位点被甲基化后再在片段的两端连接上EcoRⅠ“接头”。然后将用EcoRⅠ酶消化的上述片段连接到λgt11载体臂上,在体外包装成重组噬菌体。将重组噬菌体感染大肠杆菌Y1090,用抗P1059高免家兔血清作为第一抗体,酶标羊抗兔IgG作为第二抗体对噬菌斑进行原位筛选。用筛选出来的7个抗原基因阳性克隆株分别溶原化于大肠杆菌Y1089,在IPTG诱导下使溶原菌表达出β半乳糖苷酶——外源性多肽链融合蛋白质。用惠斯顿免疫吸附试验检测从上述7株溶原菌所获得的融合蛋白质,均显示出特异性的抗原抗体反应。用小鼠作进一步的免疫保护试验证明,有一株溶原菌(PaC_1株)的粗制裂解物能使小鼠对P1059强毒菌的攻击具有较强的抵抗力。     

从流产羔羊骨髓中分离出一株牛I型布氏菌

为考核我区经多年的布氏羊型5号菌苗气雾免疫后的效果,我们曾在酒泉、金塔、玉门、安西、敦煌等5个县(市)开展布氏菌病检菌工作,共收集牛、羊、猪可检材料1557份,其中:流产胎羔582份,在酒泉、安西检出可疑布氏菌8株。对这些可疑菌株进行了菌型鉴定和毒力测定,其结果报告如下:(一)材料与方法1.布氏菌多价诊断血清:为兰州生物制品所生产,批号:9001,效价1:3200。2.M_(104)冻干菌苗:为兰州生药厂生产。3.S_2冻干菌苗::为兰州生药厂生产。4.M_5冻干菌苗:为兰州生药厂生产。5.单因子诊断血清:ARM,系北京流行病研究所生产。6.牛型噬菌体:由北京流行病研究所生产。     

一种改进的高效模拟抗原表位噬菌体的筛选方法

以抗红斑丹毒丝菌多克隆抗体为研究对象,首先加入噬菌体与抗体作用,保证目的噬菌体与抗体的高效结合,再通过蛋白A和蛋白G能快速、高亲和力吸附抗体Fc段的特性,将抗体-噬菌体复合物固定在酶标孔中;经洗涤和洗脱后将筛选的噬菌体稀释,分装到10块96孔培养板中扩增。第1轮筛选所获得的噬菌体种类一般少于1×104个,经约1 000倍稀释后,每个酶标孔中扩增的噬菌体少于10个,这将极大地降低噬菌体因竞争扩增而丢失的概率,甚至无噬菌体丢失。结果显示,相比于传统方法从224个样品中获得36个多肽,本次从100个样品中就获得了72个多肽。同时,为满足大量噬菌体样品的验证工作,采用加入40 m L/L吐温-80的培养基在10 m L离心管中以2 m L体积扩增噬菌体,最终的噬菌体效价提高了317%,总量超过8×1010,足以满足后续试验的要求。该改进的方法可以显著提高噬菌体筛选的效率,可操作性强,具有广泛的普遍适用性。     

金黄色葡萄球菌噬菌体SP-2裂菌特性分析

为筛选高效裂解金黄色葡萄球菌的专性噬菌体,有效防控养殖场耐药病原菌感染,本研究采集奶牛场粪水样本,利用实验室培养的金黄色葡萄球菌分离裂解性噬菌体,鉴定分析噬菌体的理化特征和生物学特性,测定裂菌效率及裂菌谱;通过模拟污染地面,研究该噬菌体的环境杀菌潜力。结果显示,分离到1株双链DNA噬菌体SP-2,属于短尾噬菌体科(Podoviridae),裂菌谱广,不仅能裂解实验室耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),而且对食源性及医院临床分离的金黄色葡萄球菌也有很好的裂解作用;在体外杀菌试验中,噬菌体SP-2可在3 h内裂解MRSA菌株PNB25;环境消毒模拟试验结果显示,经噬菌体SP-2喷雾处理后,对平板内细菌的杀菌效率高达90.8%。结论,噬菌体SP-2对金黄色葡萄球菌具有高效、种内广谱的裂解作用,有望成为防控金黄色葡萄球菌感染的一种抗菌制剂及环境消毒剂。     

副鸡禽杆菌抗原表位的筛选与鉴定

用C型副鸡禽杆菌(Apg)单克隆抗体作为靶标,筛选噬菌体展示随机12肽库,从中获得与之特异性结合的噬菌体克隆,建立了一种筛选副鸡禽杆菌表位的方法.测序结果显示,第3轮筛选后,80%的噬菌体克隆具有氨基酸共同序列Y-P-Q(A)WW,舍有上述共有序列的噬菌体克隆不仅可以与靶抗体特异结合,还可与C型Apg细菌竞争结合靶抗体;将编码YSPHQWWLSGAV的DNA片段插入质粒pFliTrx的多克隆位点,转化E.coli G1826并在鞭毛成功展示;该重组菌能与靶抗体特异结合;用重组菌免疫试验鸡能产生C型Apg细菌的特异性抗体;用C型668株Apg攻毒,免疫接种鸡获得37.5%保护.提示该表位肽用于研制鸡传染性鼻炎疫苗具有广阔的应用前景.     

金黄色葡萄球菌噬菌体SP-2裂菌特性分析

为筛选高效裂解金黄色葡萄球菌的专性噬菌体，有效防控养殖场耐药病原菌感染，本研究采集奶牛场粪水样本，利用实验室培养的金黄色葡萄球菌分离裂解性噬菌体，鉴定分析噬菌体的理化特征和生物学特性，测定裂菌效率及裂菌谱；通过模拟污染地面，研究该噬菌体的环境杀菌潜力。结果显示，分离到1株双链DNA噬菌体SP-2，属于短尾噬菌体科（Podoviridae），裂菌谱广，不仅能裂解实验室耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），而且对食源性及医院临床分离的金黄色葡萄球菌也有很好的裂解作用；在体外杀菌试验中，噬菌体SP-2可在3 h内裂解MRSA菌株PNB25；环境消毒模拟试验结果显示，经噬菌体SP-2喷雾处理后，对平板内细菌的杀菌效率高达90.8%。结论，噬菌体SP-2对金黄色葡萄球菌具有高效、种内广谱的裂解作用，有望成为防控金黄色葡萄球菌感染的一种抗菌制剂及环境消毒剂。     

广东省发病猪禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分布

为了解广东省发病猪、禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛(HPI)的分布和HPI阳性菌的血清型,从广东省发病的猪、禽养殖场共分离鉴定了608株大肠杆菌,针对耶尔森菌强毒力岛的标志基因irp2基因设计1对引物,对这些大肠杆菌进行了irp2基因的PCR检测;并对HPI阳性菌进行O血清型鉴定。结果显示,有105株菌含有irp2基因,即HPI阳性率为17.27%(105/608)。猪源、鹅源、鸽源、鸡源、鸭源、鹧鸪源大肠杆菌的HPI检出率分别是16.51%、17.81%、21.05%、17.74%、19.01%及0;105株HPI阳性菌的血清型分布较为分散,没有明显规律;主要的血清型有O1、O26、O45、O114、O136、O18等。研究表明,广东省猪、禽养殖场大肠杆菌的HPI携带率较高,血清型复杂。     

金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体的分离及生物学特性鉴定

以金黄色葡萄球菌CVCC 546为宿主菌,从粪便中分离出1株噬菌体,命名为4086-1。采用双层平板法分离并纯化噬菌体,观察噬斑形态,通过透射电镜观察噬菌体形态,同时测定一步生长曲线、热稳定性、pH稳定性,并分析有机试剂、去污剂及渗透压对噬菌体活性的影响。结果显示,噬斑呈圆形、透亮,边界清晰、有晕环,直径1～3 mm。电镜观察结果显示噬菌体为短尾噬菌体。一步生长曲线结果显示,潜伏期为20min,裂解量为222 PFU/cell。噬菌体在-20～42℃范围可稳定生存,在pH为4～12范围稳定存在。用750m L/L乙醇处理30 min后,噬菌体完全失活;氯仿、500 m L/L DMSO及800 m L/L丙酮分别处理30 min,噬菌体活性无明显变化。1 g/L SDS处理30 min后,噬菌体完全失活;1 g/L CTAB和1 m L/L月桂酰胺氨酸钠处理30 min后,噬菌体效价分别降低0和2个数量级。在不同盐浓度(氯化钠浓度为0～4.5 mol/L)的环境中作用15 min后,噬菌体效价无明显变化,表明该噬菌体对渗透压有一定的耐受性。综上,通过对噬菌体4086-1生物学特性及理化特性的研究,可为其进一步应用奠定基础。     

沙门菌CRISPR与耐药性的关系及生物信息学分析

为研究沙门菌成簇间隔短回文重复序列(CRISPR),对CRISPR进行生物信息学分析,为进一步研究CRISPR功能及其对细菌耐药的影响奠定基础。对合肥市宠物医院分离鉴定的14株沙门菌进行耐药性(24种抗菌药物)和CRISPR检测,分析CRISPR与沙门菌多重耐药的关系。对沙门菌PCR产物进行测序,通过BLAST、RN A二级结构预测、CRISPR Target等生物信息学方法对沙门菌的CRISPR进行生物信息学分析。结果显示,沙门菌均对3种及3种以上药物耐药,有8株菌检测到CRISPR 1,14株菌检测到CRISPR2;CRISPR阳性菌株均为多重耐药菌株,CRISPR序列差异性与耐药性之间没有直接相关性,CRISPR序列与血清型之间有一定相关性。8株CRISPR 1阳性沙门菌重复序列均含1条(9、13号除外)长度为29 bp的重复序列,分为4类,14株沙门菌CRISPR 2的重复序列共有18类,其RNA二级结构都能形成回文结构,但茎环大小有差异。同源性比对发现,CRISPR 1中81.6%的间隔序列与质粒的基因组序列具有同源性,18.4%与噬菌体有同源性;CRISPR 2中80%的间隔序列与质粒具有同源性,16.8%与噬菌体有同源性,3.2%与细菌有同源性。结果表明,携带CRISPR的沙门菌广泛存在,CRISPR可能与沙门菌血清型相关,明确了CRISPR结构的生物学信息。     

猪源MAIC菌血清型鉴定

本试验采用Schaefer的凝集反应和凝集素吸收试验,以日本家畜卫生试验场提供的20株MAIC标准菌对我国首次从长春地区屠宰猪中分离的17株MAIC菌作了血清型鉴定,其结果,有43株鉴定为M.intracellulare,其中7株为4型,3株为9型,3株为19型。有两株分别属于M.avium 1型和3型,有两株未能定型。     

噬菌体疗法预防细菌性感染的研究进展及发展方向

由于抗生素的不合理使用,引起了细菌多重耐药性、药物残留、食品安全、环境菌群不平衡等问题,严重威胁人类及动物的健康。因此,寻找新型抗菌药物及治疗方案已成为当前的研究重点。噬菌体是感染细菌、真菌等微生物的病毒,自发现伊始便用于治疗细菌感染。与传统抗生素相比,噬菌体具有分布广、易筛选、高度的宿主专一性、增殖能力强、安全性高、研发成本低等优势。随着多重耐药菌的广泛流行,噬菌体治疗细菌感染重新引起了人们的重视。本文简述了噬菌体的生物学特性、噬菌体疗法在预防细菌感染的应用及噬菌体研究发展方向,以期为噬菌体疗法预防细菌性感染提供参考。