葡萄球菌A蛋白在猪丹毒杆菌鉴定上的应用试验

葡萄球菌A蛋白(SPA),是金黄色葡萄球菌细胞壁所含的一种蛋白质,作为一种新的免疫学试剂,在医学领域广泛应用。笔者参考国内外有关资料,用猪丹毒高免血清致敏SPA,对保存的10株猪丹毒杆菌进行了鉴定,其结果介绍如下。     

口蹄疫病毒A/WH/09株结构蛋白P1基因的克隆及其B细胞抗原表位的预测

对口蹄疫病毒(FMDV)A/WH/09株P1结构蛋白基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果显示,FMDV A/WH/09株P1基因长2 208bp,包含完整的开放阅读框,编码736个氨基酸,其中VP1长636bp,编码212个氨基酸;VP2长654bp,编码218个氨基酸;VP3长663bp,编码221个氨基酸;VP4长255bp,编码85个氨基酸。采用DNAStar Protean软件对P1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行了综合分析,并预测其B细胞的抗原表位分布。结果表明,VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞抗原优势表位,VP4上也有少量潜在的B细胞抗原表位。与已鉴定的B细胞抗原表位相比,本试验所用方法预测的结果有较高的准确度,是一种较为先进的表位研究方法。     

金黄色葡萄球菌凝聚因子A区基因的克隆表达及表达产物的免疫学特性

采用PCR技术对引起乳牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌凝聚因子(ClfA)A区基因进行了扩增和克隆测序,并对测序结果用DNAStar软件进行了抗原表位分析,成功构建了原核表达质粒pET-32a-ClfA A.将其转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,证实目的蛋白以可溶形式存在.用His·Bind柱对其纯化后获得了纯度较高的蛋白.纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗血清,通过ELISA、试管凝集试验、吞噬调理试验、抗体抗金黄色葡萄球菌黏附能力检测等对表达产物及制备的超免疫血清进行了检测.试验证明目的蛋白具有黏附活性,自制的超免疫血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用,所表达的蛋白为ClfA A蛋白.     

猪附红细胞体PPA-ELISA检测方法的建立

用物理方法纯化猪附红细胞体抗原,用纯化抗原免疫兔制备超免疫血清,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗,建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA ELISA)检测方法。结果显示,用PPA ELISA方法检测猪血液中的附红细胞体,具有很高的敏感性和特异性,重复性良好,完全适用于猪附红细胞体病的实验室诊断。     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1亚区抗原性分析

采用Bac to Bac杆状病毒表达系统 ,对猪瘟病毒A抗原区内的 2 74 4～ 2 94 7nt基因片段(EC)进行了克隆、表达 ,并分析了表达产物的抗原性。研究发现 ,EC表达产物能与抗猪瘟病毒Al fort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2 4 10、a18发生特异性结合 ,且用其免疫动物后能诱导机体产生中和抗体。结果表明 ,A1抗原亚区位于E2蛋白 791～ 85 8位氨基酸区域。     

非洲猪瘟病毒荧光量子点检测试纸条的研制

根据非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72蛋白的氨基酸序列筛选合成多肽,并与载体蛋白BSA进行偶联,将以此得到的多肽作为抗原免疫小鼠,用来制备鼠源抗ASFV VP72蛋白的单克隆抗体。将上述方法制备的针对ASFV VP72蛋白的单抗作为荧光量子点标记的抗体,以与这种标记单抗互相配对的另一单抗包被检测线（T线）,采用山羊抗鼠二抗Ig G包被质控线（C线）,建立了一种简便、快速、准确的用于ASFV抗原检测的荧光量子点免疫层析试纸条。结果表明,制备的试纸条对于猪瘟等8种猪常见疫病免疫用灭活疫苗检测时无交叉反应;可检测到8μg/m L的VP72重组蛋白;与商品化的ASFV荧光定量PCR检测试剂盒进行比对检测,其对临床样品检测的阳性符合率为82.1%(23/28),阴性符合率为93.8%(75/80)。该试纸条特异性好、灵敏度高以及稳定性好,为ASFV的现场快速初步诊断提供了一种技术支持。     

一种新的IgG结合物——链球菌蛋白G

链球菌蛋白G是A、C、G群链球菌的细胞壁内存在的一种表面蛋白。它具有与哺乳动物IgG结合的能力,由于G群链球菌的这种蛋白与IgG的结合能力最强,因此得名蛋白G。虽然早在1973年Kron-avall用致敏绵羊红细胞检测A、C、G群链球菌与γ球蛋白反应时就发现有26％的菌株能与γ球蛋白反应,但真正系统广泛地研究蛋白G的理化特性及实际应用,还是80年代的事情。现在已基本肯定蛋白G比葡萄球菌A蛋白(SPA)对IgG的结合更为优越,是一种新的更有效的IgG结合物,在免疫学研究方面将有可能取代SPA。     

斑点免疫金渗滤法检测猪生殖与呼吸综合征抗体的研究

应用提纯的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原包被硝酸纤维素膜,然后用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)建立了检测PRRS抗体水平的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)。该法通过胶体金标记SPA直接显色,阳性者出现红色斑点,整个试验过程仅需5min即可判断结果;与猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病阳性血清不发生交叉反应;纯化PRRSV抗原的最低检测量为0.0553mg mL,即55.3ng 点。对200份猪血清用该法与ELISA同时进行PRRS抗体检测,两种方法的符合率达98%。     

牛的血型

牛血型的分类研究在动物中是最详细的。用免疫学方法,可将血液的有形成分分为红细胞抗原型、白细胞抗原型、血小板抗原型和同种异型。所谓同种异型是血清成分抗原变异型的总称。用电泳方法,可将血液蛋白质(包括酶)和乳蛋白质分为血液蛋白型(红细胞蛋白型和血清蛋白型)和乳蛋白型。此外,还可以按照牛血球对家兔抗牛红血球血清的凝集性分为高低两型。这里我们主要介绍作为遗传标记因子意义较大的红细胞抗原型和血液蛋白型。     

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。     

牛病毒性腹泻病毒E_(84-170aa)~(rns)蛋白的可溶性表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的ELISA方法,对E~(rns)蛋白一个包含2个预测抗原表位的96氨基酸蛋白编码序列,经密码子优化后进行基因合成,构建重组表达载体pET-E_(84-170aa)~(rns),转化表达菌株BL21(DE3),在28℃用0.1 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达。将重组E_(84-170aa)~(rns)蛋白通过Ni~(2+)-NTA树脂亲和层析方法纯化后,用Western-blot分析其抗原性。结果显示,重组E_(84-170aa)~(rns)蛋白以完全可溶形式在大肠杆菌中高效表达,经Ni~(2+)-NTA树脂纯化获得重组E_(84-170aa)~(rns)蛋白的浓度和纯度分别为1.5 mg/mL和94%。Western-blot显示,该重组蛋白对BVDV阳性血清具有很强的抗原反应性。用纯化的重组E_(84-170aa)~(rns)蛋白建立间接ELISA方法(E_(84-170aa)~(rns)-iELISA)的结果显示,所建立方法的最佳抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶5 000,血清D450的阴阳性临界值为0.283;该方法仅对BVDV阳性血清呈特异性反应,对1∶1 280倍稀释的阳性血清仍可检出,批内试验和批间试验的变异系数均小于10%。用该方法对487份牛血清进行BVDV抗体检测,检出128份阳性血清。本研究建立的E_(84-170aa)~(rns)-iELISA方法为BVDV抗体检测及流行病学调查提供了一种有效手段。     

金黄色葡萄球菌Fc段受体结合蛋白A基因的克隆与原核表达

为研制葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)的相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从金黄色葡萄球菌基因组中扩增出了876bp的细胞壁结合蛋白SPA基因,该基因编码292个氨基酸,包含了E、D、A、B、C 5个IgG结合结构域。构建了原核表达载体pET28a(+)-SPA,经IPTG诱导,表达出分子质量约35.0ku的SPA蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPA蛋白,Western-blot分析表明纯化的SPA蛋白具有生物学活性。     

猪血清IgG提取方法的比较

目前在兽医研究工作和诊断中,对纯化免疫球蛋白Ig的质量提出了更高的要求,因此寻求一种操作简单、高效、实用的Ig提纯方法是很有必要的。为此,我们用葡萄球菌A蛋白(SPA)菌体法,饱和硫酸铵盐析法、DEAE——纤维素柱层析法纯化猪血清IgG,并加以比较,结果报告如下,供同行借鉴。 (一)材料与方法 1 饱和硫酸铵盐析法:盐析法是根据蛋白质在纯水和各种盐类溶液中的相对溶解度不同而进行的。当介质中盐份增加时,就会影响水分子与蛋白质分子极化部分的相互作用而减     

非洲猪瘟病毒p54蛋白特定抗原表位单克隆抗体的制备

为了制备针对非洲猪瘟病毒p54蛋白已知特定抗原表位的单克隆抗体,采用原核表达的重组蛋白p54免疫小鼠,并制备了原核表达p54蛋白、真核表达p54蛋白以及人工合成特定抗原表位氨基酸多肽A三种筛选抗原,筛选出了1株针对已知抗原位点的杂交瘤细胞株。对其分泌的单克隆抗体进行了亚类及特异性鉴定,并利用ProteOn XPR36大分子相互作用系统分析了该单克隆抗体的亲和性。结果显示,该单克隆抗体属IgG1亚类,特异性强、亲和力高。这为以后的免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

猪囊虫B抗原的研究进展

近年来,有关科技人员对猪囊虫抗原进行了研究。认为猪囊虫抗原成分十分复杂,头节和囊壁混合的匀浆液中含有20余种蛋白质,其中有8种以上的抗原性成分。Flisser(1980)把猪囊虫的头节和囊壁匀浆粗提后,通过免疫电泳对116份阳性血清所产生的沉淀线进行分析。结果表明,pH8.6等电成分B抗原可同84％阳性血清反应,在被阳性血清识别频率方面,居诸抗原之首。用从猪体收获的囊虫提取物接种小鼠时,B抗原也是被超免鼠血清最频识别的抗原。因此,在猪囊虫病的免疫学研究中,B抗原是十分引人注目的。 (一)B抗原的提纯 Guerra等人(1982)对B抗原提纯作了研究。首先是将去囊液的     

金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖偶联抗原的制备及免疫原性分析

为建立金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)纯化与偶联技术方法,获得具有免疫原性的CP5偶联抗原,采用高压破碎菌体的方法释放荚膜多糖,酶处理去除核酸和蛋白质,通过离子交换层析进一步纯化,得到纯化的CP5,并对其纯度和反应原性进行检测;采用己二酸二酰肼(ADH)间桥法制备CP5-牛血清白蛋白(CP5-BSA)偶联抗原,加佐剂免疫小鼠,进行抗体水平测定。结果表明,纯化的CP5纯度为675.1g/kg,经用免疫琼脂双扩散试验检测,纯化多糖仅与同型菌株抗血清发生沉淀反应,偶联抗原CP5-BSA可以刺激小鼠产生CP5免疫应答。此研究结果为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的研制提供了试验依据。     

非洲猪瘟病毒抗体量子点检测试纸条的研制

根据非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73蛋白的氨基酸序列推测抗原表位优势区域,合成多肽并与牛血清白蛋白(BSA)偶联,筛选有抗原性的多肽作为试纸条检测线的包被抗原,采用量子点作为标记材料对葡萄球菌蛋白A(SPA)进行标记,以抗SPA的多克隆抗体作为质控线的包被蛋白,制备快速检测ASFV抗体的量子点免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条与常见相关猪疫病阳性血清无交叉反应,与进口ELISA试剂盒对临床样品的检测符合率为100%;特异性强、敏感性高、稳定性好、操作简便,可用于ASFV抗体的快速检测和流行病学调查。     

应用酶联免疫吸附试验诊断弓形虫病

1984～1986年,本课题协作组在广西、北京、福建、安徽、黑龙江、浙江等省市的6个单位进行了弓形虫病酶联免疫吸附试验诊断方法的研究,建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)。 葡萄球菌A蛋白—酶联免疫吸附试验(SPA—ELISA)固相免疫酶底物珠试验(DASS),玻片虫体过氧化物酶联免疫吸附试验(TSHE),玻片虫体—葡萄球菌A蛋白酶联吸附试验(TSSH)5种酶联试验方法,现汇总报告如下。     

寄生虫动物宿主对Protein A的假免疫反应研究

Protein A是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白(Staphylococcus Protein A)成分。可与人和多种哺乳动物IgG的Fc段发生非特异的结合,Protein A和IgG的复合物与一般抗原、抗体复合物一样能激活补体;抑制IgC调理素对吞噬和杀菌的促进作用,是B淋巴细胞的一种良好的多克隆促有丝分裂原。可与IgG的Fc段发生一种非特异的、快速的化     

SPA协同凝集反应敏感性试验

近年来已广泛应用间接凝集试验的方法对未知的抗原或抗体进行检测。在间接凝集试验中所用的载体有动物的红细胞、炭素以及乳胶等。由于载体所吸附的抗原和抗体的不同,分别被称为正向或反向间接凝集试验。但间接凝集试验中的载体处理比较麻烦,常受到某些因素的影响,而且保存期一般也较短。我们根据葡萄球菌表面的A蛋白可以非特异地吸附免疫球蛋白分子中的Fc段的特性。用沙门氏杆菌多价抗血清致敏已固定了的葡萄球菌,作为沙门氏杆菌的检测方法,取得了比较满意的结果。