用猪白细胞干扰素防治猪流行性腹泻

用猪白细胞干扰素防治猪流行性腹泻刘万钧，胡景韶，张道永，姚家和，江开全，丁敦至，王劲（四川省畜牧兽医研究所成都６１００６６）（乐至世达生物技术开发公司）猪流行性腹泻（ＰＥＤ）是由冠状病毒科的猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）引起的，以腹泻、呕吐、脱水为其特...     

猪白细胞干扰素对仔猪腹泻的防治效果试验

近年来 ,我场仔猪腹泻屡有发生 ,经用大肠埃希氏菌灭活疫苗免疫预防 ,仍有部分哺乳仔猪和新断奶仔猪发病。经系统诊断 ,认为这些病例是由病毒性疾病或病毒与细菌混合感染所致。为此 ,笔者进行了猪白细胞干扰素对仔猪腹泻的预防和治疗效果试验 ,取得了较好的效果。1　药品和试验对象1.1　药品　猪白细胞干扰素 ,系四川世红生物技术有限公司生产 ;速抗速益 80 0 ,为宝来利来 (安泰 )生物工程有限公司生产 ,均由甘肃省兽医技术推广总站提供。1.2　试验对象　哺乳仔猪和断奶仔猪为本场母猪繁殖。同一项目试验所用的仔猪为日龄、体重相近 ,发育…     

猪流行性腹泻病毒M蛋白对Ⅰ型干扰素产生的影响

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白M对Ⅰ型干扰素(IFN)产生及其信号通路的影响,将PEDVM蛋白表达质粒转染HeLa细胞后用poly(I∶C)刺激,应用双荧光素酶分析系统对IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN-β、IFN刺激基因15(ISG1...     

马齿苋多糖对猪流行性腹泻病毒抑制作用的研究

提取马齿苋多糖(POP),研究它对猪流行性腹泻病毒(PEDV)体外复制的作用及机制。采用醇沉法提取POP并用纯化,选用VH细胞为模型细胞,检测纯化后的多糖对该细胞的细胞毒性。用PEDV感染VH细胞,建立体外病毒感染模型,用CCK-8和RT-q PCR的方法检测POP对细胞的保护和对病毒的抑制效果以及作用于病毒感染的时期,免疫荧光观察其对病毒复制的作用,并通过ELISA方法检测POP对体外PEDV感染模型分泌IFN-α、TNF-α、IL-6等细胞因子的影响。结果显示,POP浓度在0～25 μg/m L范围内对VH细胞无毒副作用;浓度为6.25～25 μg/m L时对PEDV具有明显的抑制作用,并呈一定的剂量依赖性,免疫荧光可以清晰观察到其对病毒复制的抑制作用。该药物主要作用于病毒感染的吸附期;其对PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6的分泌的抑制作用显著(P0.01)。由此得出:POP对PEDV感染的VH细胞具有明显的抑制作用,能抑制PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α、IL-6的蛋白含量的增加,从而发挥抗病毒的作用。     

LncRNA9606对猪流行性腹泻病毒复制的影响

长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度大于200 nt的非编码RNA分子,在调节多种生命活动中起着重要作用。本团队前期研究发现,宿主的lncRNA表达谱在猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染后发生显著变化。本研究选择其中一条差异表达的LncRNA TCONS_00009606(LncRNA9606),以研究它对PEDV复制的影响。为此,本研究首先检测LncRNA9606在PEDV感染后不同时间点的动态表达变化。结果,PEDV感染显著上调LncRNA9606的表达。随后对猪肠上皮细胞、派伊尔氏淋巴集合结以及外周血单个核细胞中LncRNA9606的表达丰度进行了分析,结果显示派伊尔氏淋巴集合结和外周血单个核细胞中的LncRNA9606含量显著高于小肠上皮细胞系细胞,并主要定位于细胞核中。在LLC-PK1细胞中过表达LncRNA9606后,PEDV复制水平显著降低。由此可见,LncRNA9606可在LLC-PK1细胞中抑制PEDV病毒的复制。     

猪流行性腹泻病毒Vero细胞微载体培养条件的优化试验

通过研究搅拌速度、pH值、血清浓度等环境条件对细胞贴壁的影响以及细胞接种密度、微载体浓度与细胞生长的关系 ,对应用微载体技术和生物反应器系统生产猪流行性腹泻病毒(PEDV )的可行性进行了探讨。结果表明 ,搅拌转速、pH值、血清浓度均对Vero(PEDV )细胞在CT 3微载体上的贴壁率和均匀分布有影响 ;当接种密度为 15 .0× 10 4 /mL时 ,即每 1mg微载体接种 5 .0× 10 4 细胞时 ,可以获得较高的细胞密度 ;随着微载体浓度的提高 ,最高细胞密度也增加 ;在CelliGen反应器中 ,采用优化的培养条件 ,细胞密度可达到 174 .0× 10 4 /mL ,是方瓶培养的 3.5倍 ,每个细胞的PEDV含量与方瓶培养相当 ,制备的疫苗免疫原性好     

猪流行性腹泻病毒流行毒株的分离与鉴定

2016年3月江苏某猪场发生了哺乳仔猪腹泻疫情,导致大部分哺乳仔猪严重腹泻和死亡。为确定此次腹泻的病原,从该猪场采集了6份仔猪腹泻样品,利用RT-PCR方法对可引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)三种主要腹泻病毒进行了检测。结果显示,6份样品均呈现PEDV阳性,而TGEV和PoRV为阴性。无菌处理6份阳性样品后分别接种于Vero细胞,进行病毒分离培养;结果,6份样品中仅JSqd3/2016接种后可产生明显细胞病变,且连续传至第5代时细胞病变仍稳定存在。对JSqd3/2016分离株利用针对PEDV S蛋白的特异单抗进行间接免疫荧光鉴定结果显示,PEDV S蛋白单抗能够特异性识别JSqd3/2016分离株感染的Vero细胞。对JSqd3/2016-F5分离株S基因和ORF3基因进行克隆测序和序列比较分析结果显示,分离获得的JSqd3/2016毒株与目前的流行毒株亲缘关系较近,与经典毒株相比S基因存在较大变异,氨基酸同源性为93.0%~93.3%。本研究结果证实,PEDV变异毒株感染是该猪场仔猪腹泻疫情的主要病因。     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的血清学方法,本研究以原核表达的猪流行性腹泻病毒AH2012株N蛋白为包被抗原,通过条件优化建立了一种快速的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。利用该ELISA检测猪流行性腹泻病毒血清时为阳性,而与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒,猪圆环病毒2型、猪呼吸道冠状病毒的阳性血清均无交叉反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5.55%;该方法与中和试验检测结果总符合率为88.75%。本研究建立的方法可以应用于我国猪流行性腹泻病毒的诊断、流行病监测以及疫苗研发时抗体水平的检测,为该病的防控提供一种有效的检测工具。     

应用RT-nested PCR检测猪流行性腹泻病毒的研究

将猪流行性腹泻病毒分离株HLJ0 2 ,经过胰酶处理后 ,在Vero细胞上增殖。利用Gen Bank中的基因序列设计合成了 2对M基因引物 ,应用RT PCR和RT nestedPCR分别扩增出HLJ0 2的 85 4bp的M全基因片段和 41 2bp的M基因部分片段 ,而在猪传染性胃肠炎病毒中和Vero培养液中未扩增出上述产物。结果表明 ,RT nestedPCR可用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)。     

猪流行性腹泻病毒重组S1蛋白的免疫原性评价

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株S1基因经密码子优化后克隆到慢病毒表达载体,在293T细胞包装PEDV S1重组慢病毒;重组慢病毒感染293T细胞,经有限稀释法筛选获得高效稳定表达S1蛋白的重组细胞系HEK-293T-S1;生产、纯化S1蛋白,添加佐剂制备成重组S1亚单位疫苗,经肌肉注射免疫实验用巴马小型猪,评价...     

猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻混合苗的免疫试验

猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻混合苗的免疫试验程庆华，牛小迎，叶成玉，解洪业，李志宁（青海省畜牧兽医科学院西宁８１０００３）１９９２年以来，青海省从四川等地陆续购进大批猪苗，继之猪流行性腹泻（ＰＥＤ）和猪传染性胃肠炎（ＴＧＥ）普遍流行。经青海省畜牧兽医...     

猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)基因序列,分别设计特异性引物,扩增PEDV N基因(750 bp)、TGEV M基因(544 bp)、PDCoV N基因(183 bp)和PRoV VP6基因(329 bp)。经过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化及特异性、敏感性、重复性试验,成功建立了快速鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法仅对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测为阳性,对口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)等主要病毒的扩增均为阴性。PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV重组质粒标准品的检出下限分别为1.57×10~2、1.57×10~3、1.57×10~2、1.57×10~2copies/L。相同条件下的重复性试验获得均匀一致的结果。应用所建立的方法检测2017—2018年采集自广西各地的270份腹泻病料,结果显示,PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56%、11.48%、10.74%、1.85%,并且存在混合感染现象。上述结果表明,所建立的多重RT-PCR方法可用于PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的快速鉴别检测及流行病学调查。     

人工感染猪流行性腹泻病毒的哺乳仔猪的病理学观察

为观察猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的哺乳仔猪的病理学变化,选取60头健康的哺乳仔猪,随机均分为A、B两组。A组仔猪经口接种PEDV细胞毒,B组作为空白对照,观察不同发病阶段A组仔猪的临床症状、剖检变化、组织切片的病理学变化。结果显示,A组仔猪潜伏期表现比较正常,仅肠道有轻微的卡他性炎症,肠道上皮细胞肿胀。前驱期仔猪出现呕吐和腹泻,肠道和淋巴结充血严重。典型症状期仔猪出现严重的腹泻、脱水、粪便恶臭等猪流行性腹泻的典型症状,严重的陆续死亡;个别组织器官出现严重病变,如肠上皮细胞脱落、肺泡融合、脾白髓萎缩、肾出现蛋白管型等。耐过仔猪生长缓慢。结果表明,A组仔猪出现典型的猪流行性腹泻的病理学变化,且病理演变过程具有一定的规律性,其致病机理可能与对肠道、肺的组织嗜性和对淋巴结、脾的免疫抑制性有关。     

猪流行性腹泻病毒黏液SIgA抗体ELISA检测方法的建立

旨在建立一种检测黏液中猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性SIgA的ELISA方法,从而评价PEDV黏膜免疫水平。首先将PEDV的S1D基因(534～789 aa)克隆至质粒载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,其表达产物以包涵体形式存在。Western-blot验证蛋白大小为32 ku,且具有抗原活性。再以8 mol/L尿素变性蛋白,经纯化、梯度复性后作为包被抗原蛋白,通过优化条件初步建立检测鼻腔和口腔黏液中PEDV特异性SIg A抗体的间接ELISA,并确定其最佳抗原包被浓度为2μg/m L;鼻腔黏液最佳稀释度为1∶1,最佳封闭液为50 g/L脱脂乳;口腔黏液最佳稀释度为1∶2,最佳封闭液为30 g/L BSA;酶标抗体最佳稀释度均为1∶2 000。最后应用该方法分别检测了84份已免疫猪的口腔、鼻腔黏液,其结果与以纯化的PEDV包被的间接ELISA相比,符合率达到95.2%。本研究中建立的检测黏液中PEDV特异性SIgA的方法简便快速,具有较好的敏感性、特异性,这为评价PEDV黏膜免疫水平提供了依据和检测标准。     

猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用

用分离自广东某猪场并适应于传代细胞生长的猪流行性腹泻病毒Ｐ－ＥＤＶＧ＿Ｖ毒株作猪流行性腹泻（ＰＥＤ）微量血清中和试验。检测了五个猪场共１５２份血清，其中未发生过ＰＥＤ的一个猪场３５份血清，抗体滴度≤１：２；三个发生过ＰＥＤ的猪场７７份血清，抗体滴度在１：４～１．５１２；一个接种过ＰＥＤ油佐剂灭活疫苗的猪场４０份血清，抗体滴度在１：８～１：１０２４。猪传染性胃肠炎、伪狂犬病、猪瘟和轮状病毒阳性血清均不能中和ＰＥＤＶ，表明该方法具有准确、可靠、特异性好、操作简便的优点。     

猪流行性腹泻的诊断与治疗

猪流行性腹泻 (Ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａ ,ＰＥＤ)是由猪流行性腹泻病毒 (ＰＥＤＶ)引起猪的一种急性肠道传染病 ,以呕吐、水样腹泻和脱水为特征。 1976— 1977年比利时和英国首先报道该病 ,以后在捷克、匈牙利和原西德等国陆续发生。我国吉林、辽宁、上海、四川先后有此病报导。 2 0 0 0年 ,山东省枣庄市峄城区某猪场暴发猪流行性腹泻。1　发病情况枣庄市峄城区吴林某猪场饲养体重 2 0— 30ｋｇ断奶仔猪5 0 0头 ,5月 12日个别猪排灰白色水样粪便 ,并有呕吐 ,逐渐加重 ,严重脱水、消瘦、眼窝下陷 ,发病猪逐日增多 ,5…     

猪流行性腹泻病毒检测方法的研究进展

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高度接触性传染病。该疫病的爆发流行,给养猪业造成巨大的经济损失。因此,灵敏、快速检测诊断PEDV感染是实施病毒防控措施的关键环节。本文对于近年来检测PEDV的实验室方法进行了总结,包括病毒分离培养鉴定、病毒电镜形态检查、血清中和试验(SNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学(IHC)、间接免疫荧光试验(IFA)、免疫层析法(IC)、核酸原位杂交技术(ISH)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)、逆转录-环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、纳米颗粒辅助聚合酶链式反应(nanoPCR)等,并分别介绍了不同检测方法在应用中的优缺点,为有效诊断及防治猪流行性腹泻病毒感染提供技术指导。     

猪流行性腹泻病毒YZ2016全基因组测序与稳定性分析

2016年我国江苏扬州某规模化养猪场暴发严重腹泻,本实验室通过RT-PCR确定其病原为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。将阳性样品接种Vero细胞,盲传5代后出现典型病变,并通过RT-PCR及间接免疫荧光试验确定成功分离到PEDV毒株,命名为PEDVYZ2016。采用分段重叠法对分离株基因组扩增测序,获得其全长序列。遗传进化分析显示PEDV YZ2016与近年流行毒株亲缘关系较近,与经典毒株亲缘关系较远。PEDV YZ2016与BJ-2011-1、LZW全基因组核苷酸序列一致性可达99. 2%,与BJ-2011-1、OKN-1/JPN/2013 S基因推导氨基酸序列一致性可达98.5%。此外,分离株S基因发生多处点突变,导致其抗原表位及糖基化位点均发生部分改变。同时,序列比对分析显示不同代次的S、ORF3、N基因核苷酸突变率均极低。结果表明,本研究分离的PEDV YZ2016株属流行变异毒株,且在传代过程中遗传稳定性良好。     

猪流行性腹泻病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

本研究旨在建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的恒温隔绝式PCR(iiPCR)。采用靶向PEDV S基因的引物和探针,通过对引物、探针、Taq酶及反转录酶等进行优化,建立了检测PEDV的iiPCR,对其特异性、敏感性和稳定性进行评价,对15份PEDV阳性样本和7份阴性样本进行检测,比较与现有的荧光定量RT-PCR方法的符合率,并对115份仔猪腹泻样本进行检测。结果显示,iiPCR的最佳反应体系为:上、下游引物各3.5μL、探针0.25μL、Taq酶1μL、反转录酶1.25μL、Buffer A 25μL、模板2μL,补足DEPC水至50L,从样本处理到报告结果仅需1 h;该方法能检出样本中的PEDV,对TGEV、PPV、CSFV等无关病原不检出,检测下限为17.5 copiesμL,对5个稀释度的阳性标准品进行检测,3次重复结果一致,与现有荧光定量RT-PCR的总符合率为90.9%;本研究建立的iiPCR对仔猪腹泻样本中PEDV的检出率为22.6%(26/115)。综上可见,本研究成功建立了检测PEDV的iiPCR,为PED的诊断提供了更为便捷并可现场使用的可靠方法。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽的筛选及其抗病毒作用

把成功构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白的阳性重组质粒pET-32a(+)-M在大肠杆菌表达系统中进行诱导表达。以表达纯化的M蛋白作为靶蛋白,利用噬菌体展示技术对随机十二肽库进行筛选,4轮淘选后,挑选出了10个与PEDV及M蛋白特异性结合力高的噬菌体单克隆,序列测定后推导的氨基酸序列分别为AGWYCTEVLCV、AYCTRHVCYLDN,多肽被命名为M2、M9。就合成多肽体外抗病毒的效果而言,间接免疫荧光试验和实时荧光定量PCR试验证明,多肽M2、M9及多肽M2与M9联合使用均能够有效抑制病毒复制,且都呈剂量依赖性。其中多肽M2抑制病毒的作用比多肽M9的高,两种多肽联合抗病毒的作用最好。上述结果为进一步研究PEDV M蛋白功能性配体和研制防治PEDV的小分子治疗制剂提供了试验依据,奠定了理论基础。