牛分枝杆菌CFP-10基因的原核表达及其表达产物的变态反应原性的鉴定

以牛分枝杆菌基因组为模板,PCR扩增获得CFP-10基因,并连入pET-32a(+)载体,获得了重组质粒pET-32a-CFP-10。将重组质粒转入宿主菌大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,重组蛋白rCFP-10以可溶形式表达并被纯化,将rCFP-10在致敏豚鼠皮内做迟发型变态反应(DTH)检测,并以PPD作为阳性对照。结果显示,测得rCFP-10组豚鼠皮肤红斑直径平均值为10mm,接近于PPD组(13mm)。结果证明,以pET-32a(+)为载体进行原核表达,获得的重组蛋白rCFP-10依然具有较强的迟发型变态反应原性,同时也证明了CFP-10具有作为皮试诊断试剂抗原的潜力,这一结果为牛结核病新型DTH皮试诊断的研究奠定了基础。     

牛分枝杆菌PPE68与Mb1230以及PPE57和PE-PGRS35的表达纯化及其在牛结核病血清学诊断中的初步应用

为筛选和评估牛分枝杆菌毒力菌株与卡介苗(BCG)基因差异区域(region ofdifferences,RD)蛋白在牛结核病诊断中的效果,本研究表达了牛分枝杆菌RD1区的PPE68、RD9区的Mb1230、R11区的PPE57和RD2区的PE-PGRS35,并纯化得到纯度大于90%的重组蛋白。通过优化条件建立了间接ELISA检测方法,并采用该方法检测了结核病阳性牛和健康牛血清中针对PPE68、Mb1230、PPE57和PE-PGRS35的IgM和IgG抗体水平,评价其在牛结核病血清学诊断中的潜力。结果显示,在结核病阳性牛中,针对PPE68、Mb1230、PPE57和PE-PGRS35的IgG抗体检出率分别为13.3%、43%、50%和30%,IgM抗体检出率分别为30%、10%、36%和33%。结果表明,R11区的PPE57和RD2区的PE-PGRS35有潜力作为牛结核病血清学检测的候选抗原,用于牛结核病的诊断。     

口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1( )中,重组质粒pcDNA3.1( )-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞,用纯化的目的蛋白进行Western-blotting鉴定,并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示,获得分子质量约55 ku的单一3D基因表达产物,其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术,证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。     

牛疱疹病毒1型gE蛋白胞外区基因的杆状病毒表达及其表达产物的免疫反应性

为获得具有生物学活性的牛疱疹病毒1型(BHV 1)囊膜糖蛋白gE,采用PCR方法从BHV 1感染的牛肾细胞全基因组中扩增出约1.7kb的gE基因,再将1 176bp的gE胞外区基因片段克隆到新型杆状病毒载体pFastBac-LIC-Bse中,构建重组转移质粒pFB-gE。将pFB-gE转化到杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,制备重组杆粒rBacmid-gE。将该重组杆粒的DNA转染昆虫细胞Sf9,获得与gE基因发生重组的杆状病毒。Western-blot分析及间接免疫荧光试验(IFA)的结果显示,重组杆状病毒在Sf9中表达了分子质量大小约为43ku的gE融合蛋白,该融合蛋白分别与小鼠抗His标签单克隆抗体和小鼠抗BHV 1多克隆抗体发生特异性结合,表明获得的gE融合蛋白具有良好的免疫反应性。本研究为进一步获得高特异性的诊断抗原奠定了基础。     

牛分枝杆菌融合基因hsp65-esat6的原核表达及产物的纯化

以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因,采用重叠延伸剪接技术(SOE)获得了融合基因hsp65-esat6,将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET65-E6,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导(终浓度为1 mmol/L),表达产物进行SDS-PAGE分析。以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western-blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明:Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分,即58 ku和30ku,二者相加与预测大小88 ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

牛分枝杆菌PtpA基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为深入研究牛分枝杆菌PtpA基因在细胞免疫过程中所发挥的具体调控作用,本研究以牛分枝杆菌基因组为模板扩增得到PtpA基因,通过分子克隆的方法构建完成PtpA基因原核表达载体,并将表达载体质粒转入感受态细菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,在约35 ku处可见特异性蛋白条带。以抗组氨酸标签(HIS)单抗为一抗,对表达产物进行Western-blot检测,结果显示,表达产物可与抗HIS标签单克隆抗体发生特异性结合,证明该蛋白为所需的PtpA蛋白。通过免疫新西兰大白兔获得抗PtpA血清,所得血清用间接ELISA方法测得的血清抗体效价超过1∶1 000 000,具有较好的灵敏性。采用制备的PtpA多克隆抗体检测表达纯化的PtpA融合蛋白及真核表达的PtpA蛋白,结果可在约35 ku和约20 ku处产生特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。本研究为后续PtpA基因调控细胞免疫的具体机制的研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒P20及P14蛋白基因的表达及其产物的抗原性分析

将牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)p20和p14基因分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX-HTb,并转化至相应的宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α中表达。P20蛋白在2个宿主中都获得了高效表达;P14蛋白在BL21(DE3)pLysS中表达量较低,而在DH5α中未见表达。对P14蛋白诱导表达过程的监测表明,P14蛋白对大肠杆菌是一种毒性蛋白。用Western-blotting分析未能检测到两种蛋白的反应条带,推测这两种蛋白可能存在构象表位。     

牛碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的生物学活性

采用巢式PCR方法克隆了牛18ku-bFGF基因完整的编码序列,并构建了原核表达载体pET-28a-bFGF,将其转化大肠杆菌BL21,在25℃低温条件下,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达5 h,用Ni-NTA亲和纯化细胞裂解上清液,经Western-blotting检测,结果显示,在特定的诱导条件下,重组牛bFGF基因在大肠杆菌中获得了表达,并且主要以可溶性状态存在于细胞中。经检测,纯化后的重组蛋白能显著促进成纤维细胞的增殖(P<0.05),其活性与商品用重组人18ku-bFGF没有差异(P>0.05)。表明,所获得的可溶性重组牛18ku-bFGF蛋白具有较高的生物学活性,可用于后续研究工作。     

牛结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的原核表达及其在牛结核病检测中的应用

采用重组PCR技术从牛结核分枝杆菌AN5基因组DNA中扩增CFP10-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-CFP10/ESAT6.重组子经酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,获得约42 ku带有6×His蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%.用HIS蛋白纯化柱纯化该蛋白,Western-blot分析显示,该融合蛋白能与抗牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应.将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ,其特异性优于结核菌素.结果表明,获得的重组融合蛋白rHIS-CFP10/ESAT6为牛结核病的诊断奠定了基础.     

结核分枝杆菌csdA基因的原核表达及其免疫原性

以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 690 bp的csdA(cold-shock dead-box protein A)基因,经限制性酶切后,与pET28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中后,重组菌经0.2 mmol/L IPTG诱导表达了csdA蛋白及Ni-His-resin纯化蛋白,经Western-blot分析,鉴定了目的蛋白的反应原性。试验结果表明,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在64 ku处获得一目的条带,具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-csdA,获得了高纯度的重组蛋白,为深入研究csdA蛋白的功能奠定了基础。     

牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到了融合基因.将融合基因片段先克隆于pMDl8-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40 ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性.     

大片吸虫钙结合蛋白2基因的克隆表达及其表达产物的免疫活性研究

通过克隆、表达大片吸虫钙结合蛋白2(FgCaBP2)基因,旨在探索其作为诊断抗原的可行性。在分析大片吸虫蛋白组数据的基础上,根据肝片吸虫CaBP2基因组序列和转录组数据,设计以NdeⅠ和XhoⅠ作为酶切位点的引物。以大片吸虫总RNA为模板,通过RT-PCR获得FgCaBP2基因,对其进行测序、生物信息学分析。构建pET-30a-FgCaBP2重组表达载体,在大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中完成诱导、表达;对纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析,并用目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果表明,FgCaBP2基因的开放阅读框长570 bp,编码189个氨基酸残基。生物信息学预测显示,FgCaBP2主要以α螺旋为主,β折叠较少,有7个β转角、4个较长的无规则卷曲、含有4个亲水区、具有较多的B细胞抗原表位。SDS-PAGE分析表明,FgCaBP2呈现出可溶性表达。Western-blot分析表明,25 ku大小的特异性目的蛋白条带能够很好地被大片吸虫感染的阳性水牛血清识别,具有良好的免疫反应性。本研究成功克隆了FgCaBP2基因,并获得了可溶性重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,是潜在的大片吸虫病诊断抗原。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的原核表达及其表达产物的免疫原性

根据GenBank中登录的副猪嗜血杆菌(HPS)D15基因鸟枪序列(登录号:NZ_ABKM01000005)设计1对特异性引物,以HPS5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增了D15基因。将其进行T-A克隆,构建pMD18D15质粒并进行序列测定和分析。结果表明,D15基因含有一个2418bp的开放阅读框,编码805个氨基酸,与D15基因参考序列的同源性为99.9%。该HPSD15基因的推导氨基酸序列具有典型Omp85蛋白家族的拓扑结构特征。以pMD18D15质粒为模板,用PCR方法扩增HPSD15基因,并将其克隆到pET-28a(+)中,构建pETD15原核表达质粒,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导重组菌,并用SDS-PAGE和Western-blot检测诱导物。结果表明,pETD15重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白的分子质量约为94ku,融合蛋白能被HPS阳性血清识别,提示该融合蛋白具有反应原性。昆明小鼠和豚鼠免疫试验结果表明,D15重组蛋白具有一定的诱导免疫保护反应的能力。     

结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。     

山羊痘病毒L1蛋白的原核表达及其功能分析

为了探究山羊痘病毒L1蛋白在病毒感染Vero细胞过程中的作用,将山羊痘病毒L1蛋白基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物。表达的目的蛋白经镍亲和柱纯化后免疫家兔制备了抗血清,通过蛋白封闭试验和血清抑制试验研究了纯化蛋白及其抗血清对山羊痘病毒感染的抑制作用。结果显示,成功表达了山羊痘病毒的L1蛋白,表达产物为48ku左右的重组蛋白,它能被山羊抗山羊痘病毒阳性血清识别。加入L1蛋白封闭,可使山羊痘病毒感染细胞的病变时间推迟12h,病毒与L1蛋白抗血清作用后效价下降了87.8%。结果表明,L1蛋白可能是山羊痘病毒的受体结合蛋白,并能在病毒侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。     

水牛IFN-γ成熟蛋白基因的原核表达及其产物多克隆抗体的制备

将水牛γ-干扰素成熟蛋白(IFN-γ)基因亚克隆至pGEX-6P-1中,成功构建了pGEX-BoIFN-γ表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)重组菌进行IPTG诱导表达。应用SDS-PAGE方法对表达产物rGST-BoIFN-γ进行分析,用GST琼脂糖凝胶柱对可溶性蛋白进行分离纯化,并采用ELISA和Western-blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。将可溶性纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,包涵体蛋白经SDS-PAGE分析后切取目的蛋白免疫小鼠以制备多克隆抗体。结果表明:重组菌经37℃0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h,表达出43 ku的融合蛋白。目的蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的30%,分别以可溶性和包涵体两种形式存在,而可溶性表达蛋白纯化后的纯度较高。获得的重组蛋白具有良好的免疫活性。均能从可溶性蛋白及包涵体蛋白免疫小鼠得到针对rGST-BoIFN-γ的特异性多克隆抗体。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的原核表达及其产物的活性检测

利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增出FMDV 3ABC基因,将其克隆到pMD18-T载体。经BamHⅠ和SalⅠ酶消化后,克隆到表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pGEX-3ABC。将该重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,经终浓度1 mmol/L的IPTG诱导,获得约70 ku的融合蛋白GST-3ABC。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白GST-3ABC可以与感染FMDV的牛血清发生免疫反应。以纯化的GST-3ABC蛋白为抗原的间接ELISA检测结果与以VP2蛋白为抗原的间接ELISA检测结果相比较,表明,融合蛋白GST-3ABC可以用于鉴别感染FMDV和疫苗免疫的牛血清。     

牛分枝杆菌Ag85A基因在大肠埃希氏菌中的表达

以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切已构建的pGEM-T-85A和pET28a( ),并将纯化的Ag85A基因亚克隆至pET28a( )中,构建出原核表达质粒pET28a-85A。将pET28a-85A转化至感受态E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约32 ku的外源蛋白带。Western-blotting分析表明,该蛋白具有牛分枝杆菌的抗原性。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

猪IFN-γ基因的融合表达及其表达产物的生物学特性

依照猪IFN-γ(pIFN-γ)成熟蛋白基因序列设计引物,将已扩增的pIFN-γ基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了GST-pIFN-γ融合表达载体,该载体转化宿主菌BL21后用IPTG进行诱导表达并对诱导表达条件进行了筛选和优化,筛选出最佳诱导表达条件后大量诱导表达,可溶性的表达产物经GST琼脂糖凝胶亲和纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化.经SDS-PAGE和Western-blot分析,证实得到了高纯度的融合蛋白,该蛋白的分子质量为42ku.选择FMDV和PRV两种不同的病毒(RNA病毒和DNA病毒)进行GST-pIFN-γ抗病毒活性测定.结果表明,GST-pIFN-γ融合蛋白可有效抑制这两种病毒引起的细胞病变,其对FMDV的抑制作用远远大于对PRV的抑制.对GST-pIFN-γ融合蛋白的稳定性及机体毒副作用的研究表明,该pIFN-γ的稳定性有较大提高,而毒副作用大大降低.