新型鹅细小病毒VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究造成鸭短喙与侏儒综合征的病原即新型鹅细小病毒（NGPV） VP2蛋白的生物学功能,根据NGPV SD株序列,扩增VP2基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白。将纯化的蛋白按照标准程序免疫7周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,NGPV VP2基因全长为2 199 bp;通过大肠杆菌BL21(DE3)成功表达出大小约为83 ku的His-VP2融合蛋白。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别受感染细胞中的NGPV和鹅细小病毒。综上所述,本研究成功表达并纯化了VP2蛋白,并成功制备了效价高反应性好的多克隆抗体,为进一步探究NGPV VP2蛋白生物学功能奠定了基础。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。     

产气荚膜梭菌EF-Tu基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

通过PCR方法扩增产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu基因,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-EF,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA、Western-blot和间接免疫荧光方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导5h后蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为69ku。间接ELISA方法检测的多抗血清效价为1∶262 144。Western-blot结果证实,重组蛋白与产气荚膜梭菌ATCC13124株制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。Western-blot和间接免疫荧光结果表明,多抗血清能分别与pGEX-EF重组蛋白、ATCC13124菌体裂解液、pcDNA3.1-EF-Tu瞬时转染后的BHK-21细胞及ATCC13124感染的小鼠肠组织中菌体发生特异性结合反应。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。     

产气荚膜梭菌plc基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western-blot方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导4～5h后重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为66ku。用间接ELISA方法检测的多抗血清效价达到1∶65 536。Western-blot结果证实,重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的反应原性,而且多抗血清能够检测产气荚膜梭菌分泌的天然α毒素蛋白。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。     

肌旋毛虫谷氨酰胺酶基因的原核表达及其免疫荧光定位研究

采用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫中扩增出谷氨酰胺酶(TsGls)基因全长序列,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,测序验证后转化到表达宿主菌Rosetta(DE3)pLysS中,用IPTG诱导表达重组蛋白TsGls。以纯化的TsGls蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对旋毛虫肌幼虫中的TsGls进行免疫荧光定位。结果显示,成功构建了重组质粒pET-32a(+)-TsGls;经SDS-PAGE分析,重组TsGls蛋白的分子质量约为72 ku;制备的多克隆抗体效价可达1.024×10~6;Western-blot分析结果显示,多克隆抗体与重组TsGls具有较强反应性;免疫荧光定位显示,TsGls蛋白存在于旋毛虫肌幼虫皮下组织。上述研究结果为进一步研究旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆与原核表达

提取小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1的总RNA,用RT-PCR方法扩增F基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒为模板克隆去掉N端信号肽和跨膜区的F基因(F-1)并亚克隆于原核表达载体pET-30a(+),得到重组质粒pET30-F-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫SPF家兔制备抗体,进行间接免疫荧光检测并用ELISA测定抗体效价.结果显示,目的基因正确插入了表达载体,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,用重组蛋白免疫3次后,兔血清抗体达到较高水平,Western-blot分析说明表达产物能够与兔血清抗体发生特异性反应,间接免疫荧光试验显示重组蛋白免疫兔阳性血清能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.表明,重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达,并且具有较好的反应原性.     

小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。     

猪细胞因子信号传导抑制因子1蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备

为制备猪细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的多克隆抗体,采用RT-PCR扩增猪SOCS1基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET28a-pSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件,并对重组蛋白pSOCS1进行纯化。以表达的重组蛋白pSOCS1免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经4次免疫,间接ELISA测得抗体效价达到1∶51 200。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体可与pSOCS1重组蛋白和经HEK293T细胞过表达的pSOCS1蛋白发生特异性反应,证明pSOCS1重组蛋白免疫原性良好。本研究为后续制备单克隆抗体、研究猪SOCS1相关作用机制奠定了基础。     

蓝舌病毒VP6蛋白的原核表达及抗体制备

本试验首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病毒1型(BTV1)的VP6基因,然后将其克隆到表达载体pPRoEx-HTb上,构建重组表达质粒pPro-VP6,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后用IPTG诱导表达,优化表达条件,纯化重组表达的VP6蛋白,免疫新西兰白兔制备抗VP6蛋白的多克隆抗体,利用Western-blot和细胞免疫荧光试验检测抗体的特异性及VP6蛋白在BTV1感染细胞中的分布。结果显示,重组VP6蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,利用组氨酸标签纯化树脂获得了高纯度的VP6蛋白;制备的抗VP6多克隆抗体不仅可与重组表达的VP6蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然VP6蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞中检测到了VP6蛋白的特异表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组VP6蛋白并制备了相应的特异抗体,为进一步揭示VP6蛋白的特性和功能奠定了基础。     

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌rv1738基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌rv1738基因,并制备针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板,PCR扩增rv1738基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-rv1738。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和纯化重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况,并用Western-bolt分析表达蛋白的反应原性。最后,以纯化的Rv1738蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a(+)-rv1738,经IPTG诱导在重组大肠杆菌中表达出分子质量为20ku的目的蛋白,并且以可溶的形式表达;对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白Rv1738能与家兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。纯化的Rv1738蛋白免疫小鼠后,能有效地刺激特异性抗体的产生,血清ELISA效价达到1∶8 800,且具有良好的特异性。以上结果表明,成功克隆表达了结核分枝杆菌rv1738基因,并制备了针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,这一结果为探索Rv1738蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制方面的潜能奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒σNS蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-YB-σNS。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功高效表达出分子质量约为58ku的融合蛋白。该融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在,表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度、诱导温度分别为4h、1mmol/L和37℃。通过对包涵体和可溶性蛋白进行尿素洗涤纯化和(或)Ni 2+柱亲和层析纯化,得到了高纯度的重组蛋白。分别对纯化前、后的重组蛋白进行Western-blot分析,结果显示两者均可以与MDRV阳性血清发生特异性反应,表明它们具备良好的反应原性。将纯化后的可溶性σNS蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶32 000。上述研究结果为后续MDRVσNS蛋白功能研究奠定了基础。     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

新型鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

应用PCR方法扩增了新型鸭细小病毒(novel duck parvovirus,NDPV)的VP3基因,然后将其克隆到原核表达载体p GEX-4T-1中,获得重组质粒p GEX-VP3。将p GEX-VP3转化BL21感受态细胞后,用1.0mmol/L IPTG于37℃进行诱导。最后,分别用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定。结果,NDPV VP3蛋白在大肠杆菌细胞中成功获得表达,表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量为84 ku。将纯化的重组VP3蛋白免疫实验家兔,制备多克隆抗体。Western-blot检测结果表明,该抗体能同时与重组的NDPV VP3蛋白及自然感染的NDPV发生反应,说明制备的抗体具有良好的抗原反应性。这些结果为进一步建立NDPV检测方法和研发新型疫苗研究奠定了物质基础。     

柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白多克隆抗体的制备及在乳酸乳球菌中的表达

将柔嫩艾美耳球虫子孢子顶膜抗原AMA1胞外域基因片段(EtAMA1)克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组质粒pET-30a(+)-EtAMA1。质粒经鉴定正确后转化入大肠杆菌中筛选阳性菌,阳性菌经IPTG诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。用表达的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。应用间接ELISA测定抗体效价,并采用Western-blot检测抗体特异性。将EtAMA1克隆入乳酸菌表达载体pTX8048中构建阳性质粒pTX8048-EtAMA1,质粒电转化入宿主菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中筛选阳性菌pTX8048-EtAMA1-L.lactis NZ9000。阳性菌经Nisin诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。结果表明,EtAMA1在大肠杆菌中以包涵体形式表达。多克隆抗体的效价为218。Western-blot检测证实,制备的抗体可与子孢子反应。重组菌pTX8048-EtAMA1-L.lactis NZ9000经Nisin诱导后,采用Western-blot检测到约61ku的目的蛋白。上述研究结果为基于EtAMA1的鸡球虫病乳酸菌口服疫苗的研制提供了重要参考。     

十二指肠贾第虫γ贾第素基因的原核表达及其表达产物的亚细胞定位

为了对十二指肠贾第虫(简称贾第虫)γ贾第素(γ-giardin)进行原核表达及亚细胞定位,研究其生物学功能,提取贾第虫总RNA,反转录成cDNA,经PCR获得γ-giardin基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a-γ-giardin,再转化入大肠杆菌Rosseta(DE3)后,用IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE验证,并用切胶纯化法纯化。针对重组蛋白制备了多克隆抗体,并用ELISA测定其效价,Western-blot分析其免疫原性,并利用免疫荧光定位技术对γ-giardin进行定位。结果表明,成功构建了原核表达质粒pET-28a-γ-giardin。表达的重组蛋白的分子质量约为38 ku,且以包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白的纯度高达90%以上。ELISA和Western-blot结果显示,γ-giardin抗体具有良好的抗原特异性与优异的抗原结合活性。免疫荧光定位结果表明γ-giardin主要位于贾第虫滋养体的腹吸盘。本研究为今后探讨贾第虫致病机制、临床诊断和治疗奠定了理论基础。     

大肠杆菌多重耐药调控基因rob的原核表达及其表达蛋白多克隆抗体的制备

提取阳性克隆质粒pMD18-T-rob,经SacⅠ+XhoⅠ双酶切,回收目的片段,定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体中,提取阳性质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,SDS-PAGE分析证实pET-28a-rob可成功地在大肠杆菌中表达出Rob蛋白。Western-blot分析证明,Rob蛋白具有良好的反应原性。表达出的Rob蛋白经侧带法纯化后免疫獭兔3次,制备抗Rob蛋白的多克隆抗体。通过间接ELISA方法检测抗体效价,结果表明抗体血清1∶40稀释时抗体效价较高。     

水牛匈爱病毒结构蛋白VP1的截短表达及多克隆抗体的制备

为了制备水牛匈爱病毒（BufHuV）结构蛋白VP1截短基因的多克隆抗体,将病毒的VP1截短基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）获得重组质粒pET-32a-BufHuV-VP1,重组质粒转化至BL21感受态细胞（DE3）后诱导表达,VP1截短蛋白的分子质量约为31.5 ku,主要以包涵体的形式表达。以纯化好的重组蛋白免疫昆明小鼠以制备多克隆抗体,通过Western-blot与IFA鉴定其特异性。结果显示,制备的小鼠多克隆抗体能与纯化的VP1重组截短蛋白和感染BufHuV的细胞表达的VP1特异性结合,表明多克隆抗体具有良好的反应原性和特异性。水牛匈爱病毒VP1截短重组蛋白及其多克隆抗体的成功制备为研究BufHuV致病机制、VP1蛋白功能以及血清学检测方法的建立提供了材料基础。     

旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备

为给旋毛虫病的诊断及疫苗研制提供备选抗原,对本实验室获得的旋毛虫Ts-Sp-7基因(GenBank登录号EU263332.1)进行PCR扩增,构建原核表达载体,进行表达纯化,Western-blot分析。制备多克隆抗体进行间接免疫荧光分析。通过PCR扩增出1 372 bp的Ts-Sp-7基因。SDS-PAGE结果显示,该蛋白大小为46 ku左右,与理论分子质量一致。Western-blot结果显示,该目的蛋白与10 000条/头感染剂量不同感染时间的猪阳性血清均呈现特异性条带。制备的多克隆抗体效价为1∶350 000。Ts-Sp-7多克隆抗体的间接免疫荧光鉴定结果显示,Ts-Sp-7蛋白在旋毛虫肌幼虫期存在于虫体表面。