非洲猪瘟病毒NP419L基因shRNA表达质粒的构建与筛选

为构建非洲猪瘟病毒(ASFV)shRNA表达质粒,以PCR扩增出非洲猪瘟病毒NP419L基因,并插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组真核表达质粒pNP419L-GFP,将其转染NIH-3T3细胞,NP419L-GFP融合基因在细胞中获得表达。针对NP419L基因设计并合成5对干扰序列,将其连接到RNAi表达载体pSuper中,构建干扰质粒pSuper-shNP419L-A,B,C,D,E,将质粒pNP419L-GFP和pSu-per-shNP419L-A,B,C,D,E分别共转染NIH-3T3细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析干扰效率。结果显示,5个干扰质粒均能抑制NIH-3T3细胞中NP419L-GFP融合基因的表达,其中pSuper-shNP419L-A,B的抑制效果较好,在87%以上,与pSuper-shNP419L-C,D,E之间均存在显著性差异(P<0.05)。表明,本试验成功构建出针对ASFV NP419L基因的RNA干扰质粒,并筛选出了有效沉默NP419L基因的干扰序列,为进一步体内试验研究奠定了基础。     

延边白鹅IFN-α基因的原核表达及其表达产物生物学活性的研究

以本实验室构建的鹅pMD18-T-IFN-α载体为基础,利用PCR技术扩增得到鹅α干扰素(IFN-α)DNA,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切,将其亚克隆到原核表达载体pET-30a上。将构建的重组质粒pET-30aIFN-α转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定;用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体并进行鉴定。结果显示,PCR扩增出的鹅α干扰素基因全长576bp;成功构建了原核表达载体pET-30a-IFN-α并得到表达;经SDS-PAGE和Western-blot检测,该蛋白的分子质量约为29ku,以纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,成功制备了多克隆抗体,血清效价为1∶32。本试验为研究鹅IFN-α的作用机理,开发有效防治鹅疾病的新型制剂奠定了基础。     

肠炎沙门菌效应蛋白AvrA的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)avr A基因功能及其在感染过程中的表达分布情况,本研究通过PCR技术克隆获得了avr A基因,并构建了肠炎沙门菌Avr A原核表达载体p Cold-avr A,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;表达蛋白经纯化后免疫小鼠获得Avr A多克隆抗体,通过Western-blot检测了抗体特异性。结果显示,成功构建了表达载体p Cold-avr A,并获得了纯化的Avr A蛋白,成功制备了小鼠抗Avr A蛋白的多克隆抗体,可用于检测细菌Avr A蛋白的表达。本研究成功获得纯化的Avr A蛋白及其多克隆抗体,为进一步探讨Avr A在肠炎沙门菌感染过程中所发挥功能奠定了基础。     

环形泰勒虫TaSDP基因的原核表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备

利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增TaSDP(Theileria annulata schizont-derived protein)基因,用获得的基因片段构建原核表达载体pET-30a(+)-TaSDP,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,蛋白以包涵体的形式存在;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并分别用ELISA和Western-blot测定抗体的效价及特异性。结果显示,获得的TaSDP基因的长度为552bp,制备的多克隆抗体不仅可与重组蛋白His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,效价高于1∶215。上述研究结果为开展TaSDP在细胞调控方面的研究奠定了基础。     

新型鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

应用PCR方法扩增了新型鸭细小病毒(novel duck parvovirus,NDPV)的VP3基因,然后将其克隆到原核表达载体p GEX-4T-1中,获得重组质粒p GEX-VP3。将p GEX-VP3转化BL21感受态细胞后,用1.0mmol/L IPTG于37℃进行诱导。最后,分别用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定。结果,NDPV VP3蛋白在大肠杆菌细胞中成功获得表达,表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量为84 ku。将纯化的重组VP3蛋白免疫实验家兔,制备多克隆抗体。Western-blot检测结果表明,该抗体能同时与重组的NDPV VP3蛋白及自然感染的NDPV发生反应,说明制备的抗体具有良好的抗原反应性。这些结果为进一步建立NDPV检测方法和研发新型疫苗研究奠定了物质基础。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。     

小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。     

西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。     

猪急性腹泻综合征冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)核衣壳(N)蛋白多克隆抗体,采用PCR方法扩增SADS-CoV/CN/GDGL/2017毒株N基因片段,并对N基因的序列以及N蛋白氨基酸突变位点进行分析。随后,将N基因片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)构建重组质粒,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化N蛋白,通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。结果表明,扩增的N基因片段和所构建的重组质粒正确无误,成功诱导表达出可溶性重组蛋白SADS-CoV-N,分子质量约为67 ku,最佳诱导时间为6 h。Western-blot以及间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体能特异性检测SADS-CoV,证明重组蛋白有良好的免疫原性。本研究为后续建立SADS-CoV快速诊断方法及该病毒致病机制的深入研究奠定基础。     

猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备猪巨细胞病毒(PCMV)gB优势抗原表位区重组蛋白的多克隆抗体,进一步分析PCMV gB蛋白的生物学特性,建立PCMV抗体血清学检测方法。对PCMV gB基因优势抗原表位区进行了PCR扩增,将回收的目的片段连接入pET32a(+)表达载体,转化入E.coli Rosetta(DE3),构建了重组表达菌E.coli Rosetta-pET32a(+)-gB,经IPTG诱导表达了gB优势抗原表位区重组蛋白。对重组蛋白进行纯化后,通过Western-blot试验验证了重组蛋白的反应原性,并免疫家兔制备了多克隆抗体。结果表明,该重组蛋白大量可溶性表达,且具有良好的反应原性。琼脂扩散试验及Western-blot检测表明,多克隆抗体效价达到1∶8,且能与gB优势抗原表位区重组蛋白特异性结合。证实,成功制备了PCMV gB优势抗原表位区重组蛋白多克隆抗体。     

多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸.对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEx-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5a后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物.结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白.对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性.     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆表达及抗原性分析

参考已发表的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP1基因序列,设计并合成了2对引物,经PCR扩增获得了2个基因片段。将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体中,成功构建了克隆载体pGEM-CIAVVP1A和pGEM-CIAVVP1B。将上述重组质粒和原核表达载体pMXB10分别用NdeⅠ+EcoRⅠ、NdeⅠ+XhoⅠ双酶切,并将纯化的2个基因亚克隆至pMXB10中,构建出原核表达载体pMXB10-VP1A和pMXB10-VP1B。在0.3 mmol/L IPTG诱导下,目的基因在大肠杆菌ER2566中以分泌型得到了大量表达。Western-blot分析发现,表达蛋白具有CIAV抗原性。表达蛋白经纯化后作为包被抗原,用间接ELISA鉴定,与CIAV阳性血清均能发生特异性反应。2组蛋白免疫SPF鸡后,用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性,表明2组蛋白均可诱发机体产生抗CIAV的抗体。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)表面蛋白(surface protein,SU protein)和抗SU蛋白的多克隆抗体,根据Gen Bank已登录的ENTV Shaanxi株SU基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增SU基因并将其连接于原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒p ET-28a-SU,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为43 ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化、复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western-blot分析结果表明,原核表达纯化的SU蛋白能够与制得的小鼠抗SU蛋白多克隆抗体特异性结合。上述结果表明,本试验成功获得了纯化的ENTV SU蛋白和小鼠抗ENTV SU蛋白的多克隆抗体,为进一步研究SU蛋白在ENTV感染过程中的作用和建立诊断方法提供了材料。     

肌旋毛虫谷氨酰胺酶基因的原核表达及其免疫荧光定位研究

采用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫中扩增出谷氨酰胺酶(TsGls)基因全长序列,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,测序验证后转化到表达宿主菌Rosetta(DE3)pLysS中,用IPTG诱导表达重组蛋白TsGls。以纯化的TsGls蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对旋毛虫肌幼虫中的TsGls进行免疫荧光定位。结果显示,成功构建了重组质粒pET-32a(+)-TsGls;经SDS-PAGE分析,重组TsGls蛋白的分子质量约为72 ku;制备的多克隆抗体效价可达1.024×10~6;Western-blot分析结果显示,多克隆抗体与重组TsGls具有较强反应性;免疫荧光定位显示,TsGls蛋白存在于旋毛虫肌幼虫皮下组织。上述研究结果为进一步研究旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌凝聚因子A区基因的克隆表达及表达产物的免疫学特性

采用PCR技术对引起乳牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌凝聚因子(ClfA)A区基因进行了扩增和克隆测序,并对测序结果用DNAStar软件进行了抗原表位分析,成功构建了原核表达质粒pET-32a-ClfA A.将其转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,证实目的蛋白以可溶形式存在.用His·Bind柱对其纯化后获得了纯度较高的蛋白.纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗血清,通过ELISA、试管凝集试验、吞噬调理试验、抗体抗金黄色葡萄球菌黏附能力检测等对表达产物及制备的超免疫血清进行了检测.试验证明目的蛋白具有黏附活性,自制的超免疫血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用,所表达的蛋白为ClfA A蛋白.     

猪乳转铁蛋白N端活性区的表达和多克隆抗体的制备

在采用亲和层析技术筛选猪嗜血霉形体表面黏附蛋白MSG1相关受体的过程中,发现猪乳转铁蛋白(LTF)可能是MSG1蛋白的潜在受体。为了对其受体功能进行确认,对截短的猪乳转铁蛋白进行了原核表达和多克隆抗体的制备。首先,以人工合成的猪乳转铁蛋白全基因为模板,通过PCR扩增猪乳转铁蛋白基因N端762个碱基后连接入pET-32a(+)载体中。其次,将重组质粒导入大肠杆菌BL-21感受态细胞中用IPTG进行蛋白诱导表达,对表达的重组蛋白用His单抗进行特异性鉴定,并对鉴定后的蛋白应用包涵体洗液进行纯化。最后,以纯化的蛋白通过背部多点皮内注射免疫小鼠和家兔制备多克隆抗体。结果,重组蛋白的分子质量在44ku左右,能够与His单抗发生特异性反应。Western-blot反应证明,制备的鼠和家兔多克隆抗体具有高度的特异性。猪乳转铁蛋白鼠和家兔多抗的制备为猪乳转铁蛋白受体功能的确认和激光共聚焦对其定位提供了技术储备。     

结核分枝杆菌rv1738基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌rv1738基因,并制备针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板,PCR扩增rv1738基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-rv1738。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和纯化重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况,并用Western-bolt分析表达蛋白的反应原性。最后,以纯化的Rv1738蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a(+)-rv1738,经IPTG诱导在重组大肠杆菌中表达出分子质量为20ku的目的蛋白,并且以可溶的形式表达;对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白Rv1738能与家兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。纯化的Rv1738蛋白免疫小鼠后,能有效地刺激特异性抗体的产生,血清ELISA效价达到1∶8 800,且具有良好的特异性。以上结果表明,成功克隆表达了结核分枝杆菌rv1738基因,并制备了针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,这一结果为探索Rv1738蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制方面的潜能奠定了基础。     

绵羊BST-2B基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了表达含有绵羊BST-2B(o BST-2B)基因的重组蛋白,用RT-PCR方法扩增绵羊肺细胞的o BST-2B基因,并将其克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组表达质粒p GEX-4T-o BST-2B。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组o BST-2B蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备抗o BST-2B的多克隆抗体。蛋白免疫印迹分析和间接免疫荧光试验检测结果显示,该抗体具有较好的反应原性。本试验成功制备的o BST-2B蛋白及多克隆抗体,为研究o BST-2B蛋白的生物学功能及羊传染病的致病机制提供了良好的基础材料。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。     

新城疫病毒M基因片段的表达纯化及其多克隆抗体的制备

M蛋白是新城疫病毒(NDV)的一个多功能结构蛋白。为了制备针对M蛋白的多克隆抗体,本研究通过克隆M蛋白部分基因片段至原核表达载体,重组蛋白在大肠杆菌中表达后进行了纯化。免疫新西兰大白兔获得血清并纯化后得到抗M蛋白多克隆抗体。Western-blot分析结果显示,该抗体具有良好的特异性。本试验成功制备的抗M蛋白多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了良好的基础。