猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达纯化及单克隆抗体的制备

猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)是新近被发现的病原,与之相关的疾病包括母猪繁殖障碍、猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、仔猪先天性震颤等。本研究采用PCR方法从PCV3/CN/GDLC1/2016株中扩增出衣壳蛋白(Cap)基因,对Cap基因进行序列分析并预测其二级结构,将去除信号肽序列的PCV3 Cap基因片段克隆到表达载体pET-32a(+)中,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,经镍柱纯化表达蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体(MAb)。结果表明,重组PCV3 Cap蛋白为包涵体,大小约38 ku,最佳诱导时间为4 h。通过镍柱成功纯化PCV3 Cap蛋白,筛选获得A8F、C6D、C7E、C6E、C9C、C9E、B7D和C11C等8株能稳定分泌抗PCV3 Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株。ELISA结果表明,A8F、C6D、C9E和B7D MAb均属于IgG2b亚类,C7E、C6E和C9C均属于IgM亚类,C11C属于IgG1亚类;A8F、B7D和C11C MAb效价均大于1∶64 000,C9E效价为1∶32 000,C6E效价为1∶8 000,C6D、C7E和C9C效价均为1∶1 000。经Western-blot分析,重组PCV3 Cap蛋白能与抗His标签抗体和抗PCV3 Cap蛋白MAb进行特异性免疫印迹反应,证实表达蛋白具有良好的反应原性。本研究为今后PCV3的防控提供了技术支持和实验基础,具有重要的生产实践意义。     

鹅细小病毒野毒株VP3基因的原核表达及抗原性检测

根据发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列设计合成了2对检测GPV的特异性引物,用其对疑似小鹅瘟的病料进行PCR检测,经序列比对后确定为GPV感染;利用引物Gs/Ga扩增获得的GPV野毒株VP3基因,测序后将VP3基因连接到原核表达载体pET-30a上,获得重组质粒pET-30a-VP3,将其转化感受态菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析.结果显示,重组菌可表达出分子质量约为66 000 u的重组融合蛋白,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中.表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,获得了纯度较高的目的蛋白.Western-blot分析结果显示,纯化的蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,证实表达的蛋白具有较好的抗原性.     

表达Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株的构建

为构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒(GTPV)弱毒株,将Asia 1型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、痘苗病毒启动子(p7.5)相连,构建成一整体基因表达盒p7.5-EGFP-P12A3C.以GTPV胸苷激酶基因序列中的Kpn Ⅰ酶切位点为插入位点.将整体基因表达盒插入转移载体骨架pUC119-TK中,构建GTPV转移载体pTK-p7.5-EGFP-P12A3C.将转移载体转染GTPV弱毒株AV 41感染的BHK-21细胞,转染后24 h就可见到绿色荧光,表明,成功获得了能表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV.     

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达

采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.将重组质粒转染BHK-21细胞.间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达.Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符.表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性.     

犬Mnx1基因过表达载体的构建及其对脂肪间充质干细胞向胰岛β细胞分化的影响

本研究旨在构建犬Mnx1基因腺病毒过表达载体,并探究Mnx1基因过表达对犬脂肪间充质干细胞向胰岛β细胞方向分化的影响。本试验构建了腺病毒重组表达载体pAD-Mnx1,经293A细胞包装扩增后产生具有感染性的重组腺病毒,将其按感染复数(MOI)100感染犬ADSCs后,分别在第3、6、9、12和15天观察绿色荧光蛋白的表达情况、细胞形态变化和胰岛β细胞发育相关基因的表达情况。结果显示,ADSCs在感染后24 h出现绿色荧光,形态无显著变化;Mnx1基因表达可激发胰十二指肠同源盒1(Pdx1)基因、神经元素3(Ngn3)基因、肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(Mafa)基因、NK2同源盒2(Nkx2.2)基因、NK6同源盒1(Nkx6.1)基因、神经分化因子1(Neurod1)基因、成对合基因4(Pax4)和GATA结合蛋白4(Gata4)基因等内源性基因的表达。结果证实,腺病毒介导的过表达载体pAD-Mnx1可在犬ADSCs超表达Mnx1基因,从而诱导犬ADSCs向胰岛前体细胞分化,具有进一步诱导犬ADSCs形成胰岛β细胞的可能。     

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。     

猪免疫调控分子B7-H4的单克隆抗体制备及其在免疫细胞中的表达分析

B7-H4分子是B7家族的成员之一。在人和小鼠的研究显示,该分子对T细胞免疫学功能的发挥具有重要调节作用。但是该分子在猪免疫系统中的功能还没有报道。本研究通过PCR技术扩增到了猪的免疫调控分子B7-H4(pB7-H4)的基因片段,并将其克隆到pET-32a(+)原核表达载体,获得了pET-32a-pB7-H4。用原核表达并纯化的重组pB7-H4蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA筛选出了1株抗pB7-H4蛋白的单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株3C8,MAb亚类鉴定结果显示其抗体亚类为IgG1。流式细胞仪分析结果显示,该MAb能特异性结合细胞系上瞬时表达的pB7-H4。利用该单抗进一步分析pB7-H4在猪外周血T淋巴细胞、巨噬细胞和肺泡巨噬细胞上的表达,结果,pB7-H4在肺泡巨噬细胞和外周血巨噬细胞中高效表达,但是在T淋巴细胞中检测不到明显的表达。上述研究结果表明,该单抗的制备为进一步研究pB7-H4的免疫学功能提供了有效工具。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达

参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物.通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/Ⅴ结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS.SDS-PAGE分析表明,经用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52 ku的目的蛋白条带.Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性.     

金黄色葡萄球菌凝聚因子A区基因的克隆表达及表达产物的免疫学特性

采用PCR技术对引起乳牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌凝聚因子(ClfA)A区基因进行了扩增和克隆测序,并对测序结果用DNAStar软件进行了抗原表位分析,成功构建了原核表达质粒pET-32a-ClfA A.将其转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,证实目的蛋白以可溶形式存在.用His·Bind柱对其纯化后获得了纯度较高的蛋白.纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗血清,通过ELISA、试管凝集试验、吞噬调理试验、抗体抗金黄色葡萄球菌黏附能力检测等对表达产物及制备的超免疫血清进行了检测.试验证明目的蛋白具有黏附活性,自制的超免疫血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用,所表达的蛋白为ClfA A蛋白.     

鸡柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株3-1E基因的重组表达及其表达产物的免疫保护性

应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株子孢子表面抗原3-1E基因,再克隆至质粒载体pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-3-1E,采用EcoR I+Hind III双酶切法及PCR扩增鉴定正确后,将3-1E基因cDNA目的片段亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a-3-1E,用EcoR I+Hind III双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确.表达蛋白的SDS-PAGE分析表明,表达产物与预期大小(36.47 ku)一致,为可溶性表达.对诱导时间以及IPTG浓度的优化结果表明,当诱导6 h且IPTG浓度在0.8 mmol/L时表达量最大.Western-blot分析表明,表达的蛋白可被感染柔嫩艾美耳球虫鸡的阳性血清特异性识别.将重组3-1E蛋白纯化后分为肌注蛋白组和肌注蛋白加弗氏完全佐剂组免疫AA鸡,通过计算抗球虫指数检测其保护力.结果显示,肌注重组蛋白组与肌注重组蛋白加弗氏完全佐剂组均能刺激鸡体产生一定的免疫反应,对柔嫩艾美耳球虫感染产生有力的保护,其中后者优于前者,表明该重组3-1E蛋白具有研制成亚单位疫苗的潜力.     

新城疫病毒HN基因在CHO/dhfr-细胞中的表达

为了实现新城疫病毒血凝素一神经氨酸酶(HN)基因在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达,构建了同时含有HN基因和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的真核表达载体pCI-HN-D.将纯化后的重组质粒通过脂质体转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO/dhfr)细胞,经3轮氨甲喋吟加压筛选,获得了稳定表达HN基因的细胞株.用间接免疫荧光和免疫印迹检测目的蛋白的表达情况.结果表明,HN基因在CHO/dhfr细胞中成功表达.     

微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因的克隆与原核表达

提取微小隐孢子虫鼠基因型卵囊总RNA,用RT-PCR扩增微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因并克隆到pMD18-T载体中.将鉴定正确的序列亚克隆于原核表达载体pET-28b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫动物后检测血清抗体.结果显示,克隆的目的基因核苷酸序列与GenBank登录的序列的同源性为98.66%.目的基因在大肠杆菌中以可溶形式高效表达.表达的重组蛋白占菌体可溶性总蛋白的57.5%,纯化的重组蛋白纯度达95.2%.重组蛋白可被兔抗微小隐孢子虫血清特异性识别,用重组蛋白免疫3次后,兔血清特异性抗体达到较高水平.表明,该重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性.     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒(GPV)的检测抗原,利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VP1与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP(1-3),分别转染sf9细胞,得到重组病毒,分别表达出了54 ku的NS2融合蛋白和24 ku的VP(1-3)融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实,表达产物具有特异性;间接免疫荧光试验证实,重组蛋白在细胞中获得了表达。     

口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响

将携带O型FMDVChina 99株P1 2A、部分 2B及 3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDVChina 99株 3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠。以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素 (PHA)刺激后的增殖活性 ,以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化 ,并以微量中和试验检测中和抗体水平。结果表明 ,FMDDNA疫苗与 3D蛋白共同免疫豚鼠后 ,抗体水平没有明显提高 ,攻毒后的保护率为 2 5 %。     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

鸡Toll样受体3胞外区片段的克隆表达及多克隆抗体的制备

以笔者所在课题组扩增测序的广西三黄鸡Toll样受体3(TLR3)基因为基础,采用降落PCR法从鸡外周血淋巴细胞中扩增其胞外功能区片段chTLR3-LRR,并构建该片段的原核表达重组质粒,通过优化蛋白表达条件,用获得的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过Western-blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,该片段长度为834bp,与预测的片段大小、碱基序列相符;构建的原核表达重组质粒pET-chTLR3-LRR经IPTG诱导后,表达出预期的30ku的重组蛋白,所获得的鼠抗鸡TLR3多克隆抗体能够与经传染性法氏囊炎病毒(IBDV)刺激后的鸡胚成纤维细胞的TLR3蛋白发生特异性免疫反应。表明,所选择的区域片段具有很好的免疫原性,制备的鼠抗鸡TLR3多抗具有良好的特异性,这为进一步研究鸡TLR3的功能提供了重要材料。     

猪生殖与呼吸综合征病毒分离株dNsp2基因的原核表达

参考GenBank中收录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JXA1株Nsp2基因序列,设计了1对引物用于扩增截短的Nsp2(deleting Nsp2,dNsp2)基因,用BamH Ⅰ+Xho Ⅰ双酶切后将目的基因插入到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,dNsp2基因得到了高效表达,融合蛋白的分子质量约为36.5 ku,表达产物以可溶性方式存在于表达上清液中,表达量可达菌体总蛋白的30%以上,表达产物能被PRRSV变异株抗体所识别,具有较好的生物学活性.PRRSV变异株dNsp2基因的高效表达为该病毒ELISA检测方法的建立及应用奠定了基础.     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

利用RT PCR技术 ,用包容口蹄疫病毒完整VP1基因的引物从口蹄疫分离株 (China/99 2 )中扩增得到一约 75 0bp的DNA片段 ,克隆后 ,经对该片段的核苷酸序列进行测序和同源性比较 ,显示其与国外同源参考序列 (O1K/66)的同源性为 80 .44% ,与国内同型参考株 (HB/WH/99)的核苷酸序列的同源性达 99.0 6%。随后以重组质粒pGEM VP1为模板 ,用特异性表达引物扩增得到目的基因VP1 (65 0bp) ,对目的基因和表达载体 pGEX 4T 1分别以相同的限制性内切酶酶切后构建成重组表达载体 ,转化宿主菌BL2 1 (DE3 )后得到重组质粒pGEX VP1 ,经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序证明目的基因正确插入到表达载体。用IPTG诱导VP1基因的表达 ,收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳、Western blotting分析检测。结果表明 ,结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中表达 ,表达产物的分子量约为 5 3ku ,并能被口蹄疫阳性血清所识别。经薄层扫描分析 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .0 0 %。证明口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中高效表达 ,且表达产物有一定的生物学活性     

猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以全长基因组重组质粒pSK-PTVFL为模板扩增了3D基因,并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a(+)中,阳性质粒转化BL21(DE3),阳性菌经0.3 mmol/L IPTG诱导后,进行Western-blotting检测。结果显示,3D蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的66.1%,且重组蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性反应。表明,3D蛋白能在大肠杆菌中高效表达,并具有良好的免疫原性,这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。     

具有中和活性的鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗鸭肠炎病毒(DEV)的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行鉴定,本研究采用蔗糖密度梯度离心法提纯DEV鸭胚成纤维细胞适应毒,以此作为抗原免疫BALB/c小鼠,随后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,有限稀释法克隆杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗DEV MAb的杂交瘤细胞株2E3。鉴定结果显示,该MAb为Ig M亚类,ELISA效价可达到1∶10~5以上;间接免疫荧光试验(IFA)中MAb可与细胞中增殖的DEV结合,Western-blot试验中MAb不与变性病毒蛋白作用,表明该MAb可能是构象表位的单抗;病毒中和试验表明,该MAb具有较强的病毒中和活性。上述结果表明,本试验获得的一株具有DEV中和活性的MAb杂交瘤细胞株为建立DEV的检测方法和DEV的相关研究提供了材料支持。