表达Ⅶ型新城疫病毒F蛋白的延迟裂解型沙门菌DNA疫苗载体的构建

为了构建表达新城疫病毒Ⅶ型F蛋白的延迟裂解型沙门菌载体,本试验首先通过PCR技术将Flag标签携带到pUC-F-opt片段中,构建出pUC-F-opt-Flag片段,再将构建好的片段克隆到沙门菌载体pYA4545中,构建重组质粒pYA4545-pUC-F-opt-Flag,并将重组质粒转染HEK-293 T细胞,收集细胞总蛋白。通过Western-blot检测目的蛋白的表达情况。同时将真核表达质粒转染Caco2细胞,并以间接免疫荧光试验检测蛋白表达。结果显示,成功构建了重组质粒pYA4545-pUC-F-opt-Flag,经Western-blot和间接免疫荧光法检测目的蛋白成功表达,为后期试验奠定了基础。     

联合表达PPV VP2和PCV2 ORF2基因的重组PRV的构建

将包含有完整阅读框架的PPV VP2基因(1 740 bp)和PCV2 ORF2基因(750 bp)插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA215株的DNA共转染Vero细胞,转染后20 h出现带荧光的空斑,挑斑纯化后繁殖,并收获病毒液.PCR和免疫荧光试验结果证实,成功构建了重组病毒,将其命名为PRV SA215(D1)株.细胞培养特性试验结果显示,重组病毒可以在Vero、MDBK、ST和IBRS-2等多种细胞上增殖,在Vero细胞上的增殖效价为1×106PFU.分别以1×106PFU/头、1×104PFU/头剂量接种28日龄仔猪,结果显示,免疫仔猪的PPV、PCV2抗体水平均逐渐升高,并分别从接种后第14 d和21 d开始,PPV、PCV2抗体转为阳性.此结果进一步佐证了重组PRV SA215(D1)株已构建成功.     

野鸭源新城疫病毒V蛋白基因在DF-1细胞中的表达及V蛋白的亚细胞定位

为研究野鸭新城疫病毒V蛋白基因在真核细胞中的表达及V蛋白的亚细胞定位,将新城疫病毒V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-V重组表达质粒,经脂质体转染DF-1细胞后,用Western-blot验证该基因在DF-1细胞中的表达;用激光共聚焦显微成像技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-V在外源真核细胞DF-1中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。研究结果为进行野鸭源新城疫病毒V蛋白的功能研究奠定了基础。     

我国新城疫强毒株F糖蛋白基因的体外合成及其抗原性研究

将我国新城疫强毒株Ｆ４８Ｅ９在ＳＰＦ鸡胚增殖后提取ＲＮＡ，用自行设计的一对寡聚核苷酸引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，合成了Ｆ糖蛋白基因片段。将此片段与ｐＵＣ１９质粒重组，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，从阳性克隆中提取重组质粒，再用ＰＣＲ法扩增，获得了同样大小的ＤＮＡ片段。经用特异性抗体探针检测，证明该片段在大肠杆菌中的表达产物具有良好的抗原性     

新城疫病毒HN基因与T4噬菌体SOC基因在大肠埃希氏菌中的融合表达

用RT PCR方法扩增了新城疫病毒 (NDV)的完整HN基因序列 ;设计了 1对带有EcoRⅠ限制位点的引物 ,用PCR扩增出了HN基因片段。将该片段克隆至 pSOC质粒SOC基因 3′端 ,成功构建了重组质粒pSOC HN。用该重组质粒转化E .coliBL 2 1(DE3)感受态细胞 ,以终浓度 1mmol/mL的IPTG诱导表达。在SDS PAGE凝胶上可检测到分子质量约 6 7ku的特异条带 ,蛋白质印迹法证实 ,表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性     

新城疫病毒F蛋白免疫活性片段的原核表达

利用已构建的新城疫病毒F基因重组质粒,通过氨基酸序列分析和InsightⅡ基因工作站的MODELER程序和同源模建技术,预测了试验株F蛋白的表面抗原分布位置.设计引物扩增了2段含有多个抗原位点的多肽片段,通过双酶切定向克隆到原核表达载体pET32a,获得了重组质粒pET32a-F1和pET32a-F2以及2个片段串联起来后克隆的重组质粒pET32a-F3.重组质粒经诱导表达并取产物进行分析,结果显示,F1、F2、F3片段均获得了融合表达.Western-blotting证实,表达产物F1、F2和F3与NDV阳性血清均具有免疫反应性.用表达的重组蛋白加免疫佐剂经皮下接种免疫鸡,免疫2次后产生较高的抗体水平,用100 LD50的超强毒株GD-05-2攻击,重组蛋白免疫组鸡可达到约70%的保护率,并可显著抑制排毒.     

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2.将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代,用PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV2核酸;间接免疫荧光可以检测到绿色荧光,表明有PCV2抗原存在.证明构建的双拷贝重组质粒具有感染性.     

新城疫病毒F48E9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因1700 bp克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建成表达F基因的载体pc3F.然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的3800 bp DNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒(HVT)非必须片段载体pTK2B中,构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒载体pTK3F.经限制性内切酶酶切分析,F基因表达盒的插入方向与pTK2B中TK基因转录方向一致.该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的HVT重组病毒奠定了基础.     

重组鹅源新城疫病毒HN基因乳酸菌的构建

构建了重组鹅源新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸杆菌后,将HN基因亚克隆至可在乳酸杆菌和大肠杆菌中穿梭表达的载体pSIP409中。此后,将构建的阳性重组体pSIP409-HN采用电转化方法转化至植物乳酸杆菌感受态细胞中。利用SDS-PAGE和Western-blot检测HN蛋白的表达情况。为明确HN蛋白的表达位置,利用流式细胞术检测了重组菌细胞是否有HN蛋白的表达。结果显示,克隆了NDV HN基因,构建了阳性重组质粒pSIP409-HN;鉴定结果表明,阳性重组质粒pSIP409-HN被成功电转化至乳酸杆菌感受态细胞中。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,构建的重组菌可以表达与HN蛋白已知大小相符的条带(66ku),且该蛋白能与NDV阳性抗体反应,具有反应原性。流式细胞术检测结果表明,HN蛋白被表达于菌体细胞表面,可作为黏膜疫苗的候选抗原。     

新城疫热稳定性天然弱毒B95株核酸疫苗的构建

将含有新城疫热稳定性天然弱毒B95株F基因的重组克隆质粒 pGEM F用NotⅠ单酶切 ,电泳回收纯化目的片段 ,与同样用NotⅠ单酶切并经去磷酸化处理的真核表达载体 pcDNA3.1连接 ,构建了新城疫核酸疫苗 ,并用所构建的新城疫核酸疫苗与载基因阳离子脂质体结合进行了免疫试验 ,通过ELISA、淋巴细胞转化试验检测了核酸疫苗在鸡体内的表达。结果显示 ,表达产物作为抗原物质刺激机体产生了特异性应答反应 ,引起了机体特异性的体液免疫和细胞免疫 ,对新城疫强毒攻击的保护率为 75 %。     

基因Ⅶ型新城疫病毒融合前构象F蛋白的表达及结构分析

目前,新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的融合前构象是未知的,为获得具有融合前构象的NDV F蛋白,本研究对基因Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化,将其克隆至真核表达载体中构建获得了重组质粒pCAG-optiF.通过SWISS-MODEL网站对蛋白结构进行预测,结果...     

表达EGFP蛋白新型重组新城疫病毒疫苗载体的构建

为构建新型新城疫病毒(NDV)载体疫苗,前期我们将La Sota全长c DNA中的F基因编码区替换为基因Ⅶ型NDV的F基因编码区,并将其裂解位点突变为弱毒株的序列,构建获得了p NDFLSP-m F重组质粒。为探索p NDFLSP-m F是否能够作为载体有效地表达外源蛋白,在p NDFLSP-m F的P基因与M基因之间引入PmeⅠ酶切位点,并将EGFP基因编码区克隆至构建好的p NDFLSP-m F载体中,构建含有EGFP基因的重组质粒p NDFLSP-m F-EGFP。将p NDFLSP-m F-EGFP以及辅助质粒p CI-NP-K、p CI-P-K、p CI-LK共转染表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞,拯救获得了重组病毒La Sota-m FEGFP。通过RT-PCR证明,被拯救的重组病毒中含有插入的外源基因EGFP。荧光观察和Western-blot分析结果表明,EGFP蛋白能在重组病毒中稳定表达。生物学特性测定结果显示,La Sota-m F-EGFP具有低毒力毒株特征,MDT为144 h,能够在鸡胚上有效地复制,EID50为1×108.75/0.1 m L。上述研究结果为研制和开发新型NDV载体疫苗奠定了基础。     

PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原优势区基因真核表达质粒的构建及其免疫效果

采用PCR法扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2抗原优势区(ORF2′)基因和猪细小病毒(PPV)VP2基因,将目的基因定向插入真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2′-VP2。将重组质粒免疫小鼠,同时设立PCV亚单位疫苗、PPV灭活疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,PCV2和PPVIgG抗体效价进行了检测。结果表明,从免疫后第7d起,pCI-ORF2′-VP2免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和抗PCV2、PPV的特异性抗体效价都显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于空载体对照组,且重组质粒组在第21～42d诱导的免疫水平显著或极显著强于PPV灭活疫苗组。证实,构建的重组质粒pCI-ORF2′-VP2能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的延迟裂解型沙门菌DNA疫苗载体的构建

为了构建表达禽流感病毒H9N2亚型血凝素HA2蛋白的延迟裂解型沙门氏菌载体,本试验首先将绿色荧光片段EGFP插入到真核表达载体p YA4545中,构建重组质粒p YA4545-EGFP,并转染巨噬细胞系RAW264.7,共聚焦显微镜下观察其表达情况;再通过PCR技术扩增HA2基因,将其克隆到沙门菌载体p YA4545中,构建重组质粒p YA4545-HA2,继而转染HEK-293T细胞,收集细胞总蛋白,通过Western-blot检测HA2蛋白的表达情况;最后将重组质粒电转到沙门菌宿主χ11218中,检测重组菌对阿拉伯糖的依赖性。结果,p YA4545真核表达体系能够有效表达;重组质粒p YA4545-HA2的HA2蛋白成功表达;重组菌对阿拉伯糖具有明显依赖性。本试验成功获得了以延迟裂解型沙门氏菌为载体表达禽流感病毒HA2蛋白的菌株,为后续开发以HA2为目标抗原的新型口服疫苗奠定了基础。     

猪瘟病毒囊膜蛋白基因pcDNA4.0-E重组质粒的构建及其对小鼠的免疫原性

以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板,应用RT-PCR方法,克隆得到猪瘟病毒囊膜蛋白E0-E2cDNA全序列,并将其与真核表达质粒pcDNA4.0定向连接,构建了重组质粒pcDNA4.0-E。经提纯后,给试验组小鼠后肢胫前肌注射pcDNA4.0-E,每只100μg,15 d后再注射1次,同时设空白对照组。于二免后第10、203、0 d分别扑杀小鼠,进行免疫小鼠脾和外周血淋巴细胞的转化增殖试验,并用间接ELISA法检测血清抗体水平。结果显示,与空白对照组相比,所构建的重组质粒能够极显著增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞的增殖(P<0.01),血清抗体水平从二免后的第10 d开始逐渐升高,且极显著高于对照组(P<0.01)。说明该重组质粒能够诱导小鼠产生特异性免疫反应。     

基于同源重组技术的表达CRE重组酶的减毒沙门菌的构建及功能初步研究

为了构建表达Cre重组酶的减毒沙门菌,本试验首先将Cre重组酶表达框插入到自杀质粒pYA3599中,构建重组自杀质粒pYA3599-Cre,电转至感受态χ7232中,经酶切鉴定与测序后,电转至χ7213感受态中,得到含有自杀质粒pYA3599-Cre的重组菌χ7213。随后通过同源重组,经两步筛选,将Cre重组酶表达框整合至减毒沙门菌χ11802的基因组中,得到重组减毒沙门菌χ11802-Cre,通过Western-boltting技术检测重组酶Cre的表达,进而将报告质粒pYA4545-lox P电转至重组菌中验证Cre重组酶的功能。结果显示,成功构建了自杀质粒pYA3599-Cre,并基于同源重组技术成功将重组酶Cre表达框整合至χ11802基因组中,通过Western-blotting成功检测出重组酶Cre的表达,且报告质粒电转至重组菌中可被切除lox P位点之间序列。本试验成功构建出能表达重组酶Cre的减毒沙门菌,为后期以位点特异性重组酶Cre为基础的减毒沙门菌微环DNA疫苗的构建奠定了基础。     

表达基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

为了构建并筛选表达新城疫病毒(NDV)F蛋白的重组鸡痘病毒(rFPV-F),通过PCR扩增F基因,克隆至pMD18-T Simple载体,进行DNA序列分析和遗传进化关系分析。将测序正确的F基因克隆至笔者所在实验室自行构建的新型鸡痘病毒穿梭载体pTS2GFPV150中,获得重组质粒pTS2GFPV150-F。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染鸡胚成纤维细胞进行同源重组,挑取表达增强型绿色荧光蛋白的噬斑,经多轮筛选获得重组病毒rFPV-F,应用PCR、RT-PCR、Western-blot等方法对重组鸡痘病毒进行鉴定。结果显示,成功获得NDV F基因及重组F基因的鸡痘病毒rFPV-F,并证实F基因已被整合到鸡痘病毒基因组中,且在感染细胞内被成功表达。本研究成功获得了1株表达NDV F基因的重组鸡痘病毒,为下一步开展动物体内免疫研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3'端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

猪细小病毒SC-1株VP2基因的定点突变及其对该基因表达的影响

根据GenBank中的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列设计并合成了2对突变引物,对PPV SC-1株VP2基因进行了定点突变.利用重叠延伸PCR技术分别将VP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突变为精氨酸,并定向克隆入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建含报告基因EGFP的重组质粒pPI-2.EGFP.VP2(A)、pPI-2.EGFP.VP2(B);利用脂质体介导法将上述重组质粒转染COS-7细胞,从而研究该突变对VP2基因表达的影响.结果显示,成功构建了合突变体及EGFP的真核表达载体;在倒置荧光显微镜下,突变后的质粒转染呈现不同的荧光信号,A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中,而B样品与阳性对照相似,荧光信号均匀分布于细胞中.提示,突变的引入是导致表达差异的主要原因.     

猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV-2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析,结果表明,克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92.0%~93.3%,推导氨基酸序列的同源性为82.9%~84.6%。重组质粒pMD18-T-ORF2经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES,成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。