猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种高效准确检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的实时荧光定量PCR方法,以FIPV N基因为靶基因设计特异性探针和引物,构建质粒标准品。通过优化反应条件,建立real-time PCR方法,并进行临床检测。经方法优化,所建立方法的标准曲线为y=-3.137x+42.243,R²值为0.999,扩增效率E为108.0%。该方法与猫瘟病毒(FPV)、猫疱疹病毒(FHV)和猫杯状病毒(FCV)无交叉反应,特异性良好;检测最低拷贝数为9.250 copies/μL,比常规PCR方法高出100倍;组内、组间变异系数均小于5.0%,重复性好。采用建立的方法和EvaGreen real-time PCR方法对39份临床样品进行检测,结果,检出阳性样品数分别为24和22,经Kappa检验,两者高度一致。上述结果表明,本研究成功建立了高效、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,可用于FIPV的临床病例检测。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,并将其应用于临床样品FHV-1的快速检测。根据GenBank已发表的FHV-1 TK基因序列的保守区域设计合成1对引物,通过对反应体系的优化,建立了FHV-1 PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、稳定性。结果显示,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法对猫杯状病毒(FCV)、猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)均无交叉反应;可检测病毒DNA模板的最低浓度为3.78×101copies/μL;应用该方法从22份猫临床样品中检出17份FHV-1核酸阳性样品。上述结果表明,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法特异、灵敏、快速、可重复,适合于临床FHV-1的快速检测。     

猫泛白细胞减少症病毒纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种灵敏且快速检测猫泛白细胞减少症病毒（FPV）的分子检测方法,本研究采用纳米颗粒与普通PCR技术相结合,通过使用Oligo 7设计FPV的特异性引物,建立FPV Nano-PCR分子检测方法,并与普通PCR方法进行对比分析。结果显示,所建立的Nano-PCR的敏感度是普通PCR的10倍（10 fg/μL）;特异性试验表明,Nano-PCR只检测猫泛白细胞减少症病毒时呈阳性反应,而检测猫杯状病毒（FCV）、猫疱疹病毒（FHV）以及F81细胞cDNA/DNA时呈阴性反应。利用两种方法对采集的26份临床病料进行平行检测,发现Nano-PCR与普通PCR阳性率分别为53.84%和42.31%。上述结果表明,所建方法具有敏感性好、特异强、简捷快速等优点,可应用于临床样品的快速检测和鉴定,为猫泛白细胞减少症的早期诊断和防控提供了一定技术保障。     

猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的方法,本研究根据GenBank上登录的FHV-1 UL55序列设计特异性探针及引物,筛选最佳引物对,建立了FHV-1的重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。该方法在39℃反应20 min即可快速、特异性地检测FHV-1。灵敏性试验结果显示,RAA最低检测限为7.60×10¹ copies/μL,比普通PCR最低检测限高100倍。特异性试验结果显示,该RAA方法与猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫细小病毒无交叉反应。对34份临床样本进行检测,其中13份为阳性,阳性检出率为38.23%。综上所述,本研究成功建立了猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法。     

猫杯状病毒GX2019的分离鉴定及全基因克隆遗传进化分析

从南宁某宠物医院疑似感染猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)猫鼻咽拭子中,利用F81细胞分离1株FCV后,RT-PCR和电镜鉴定,测定TCID_(50)和理化性质。同时利用RT-PCR分段扩增病毒全基因序列,进行同源性及遗传进化分析。结果显示,FCV GX2019分离株的TCID_(50)为1×10~(-8.67)/0.1 mL,基因组全长为7 687 bp,与FCV CH-JL4(长春株)毒株核苷酸序列相似性最高,为85.3%,属于同一分支。氨基酸分析表明,与国内FCV疫苗株255、国外FCV疫苗株F9、FCV跛行综合征株2280及FCV GX01分离株氨基酸变异率分别为46.7%、26.7%、53.3%、40.0%,其中B细胞抗原识别表位中氨基酸位点发生了改变。     

猫杯状病毒GX2019的分离鉴定及全基因克隆遗传进化分析

从南宁某宠物医院疑似感染猫杯状病毒（Feline calicivirus,FCV）猫鼻咽拭子中,利用F81细胞分离1株FCV后,RT-PCR和电镜鉴定,测定TCID_(50)和理化性质。同时利用RT-PCR分段扩增病毒全基因序列,进行同源性及遗传进化分析。结果显示,FCV GX2019分离株的TCID_(50)为1×10~(-8.67)/0.1mL,基因组全长为7687 bp,与FCV CH-JL4（长春株）毒株核苷酸序列相似性最高,为85.3%,属于同一分支。氨基酸分析表明,与国内FCV疫苗株255、国外FCV疫苗株F9、FCV跛行综合征株2280及FCV GX01分离株氨基酸变异率分别为46.7%、26.7%、53.3%、40.0%,其中B细胞抗原识别表位中氨基酸位点发生了改变。     

猫杯状病毒反向遗传平台的研究进展

猫传染性鼻-结膜炎是由猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)引起的猫科动物高度接触性传染病。目前,FCV呈世界性分布,具有跨种传播的潜力和风险,严重威胁猫科动物的健康。反向遗传学技术是通过DNA分子重组技术有目的、精确定位改造基因来确定基因变化对表型性状的影响,其从分子水平开展RNA病毒研究的目的性更强,在病毒的蛋白功能、基因表达调控、致病机制以及疫苗开发等研究中具有优势,并且已成为研究病毒基因结构、功能和疫苗研发的常用手段。本文对FCV反向遗传技术的研究及应用概况进行综述,以期为FCV及同科病毒的研究提供参考。     

猫钩虫PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、敏感的检测猫钩虫的方法,根据钩虫内转录间隔区(ITS)部分序列的保守引物AF和AR,建立PCR检测方法,对反应条件进行优化,并进行特异性和敏感性试验;采用该方法对112份流浪猫粪便进行临床检测。结果显示,建立的PCR方法能特异性扩增猫钩虫相应的基因片段,其长度为404bp,与猫弓首蛔虫、犬复孔绦虫、狐毛尾线虫的虫卵的基因组DNA以及蓝氏贾第虫包囊、猫等孢球虫卵囊基因组DNA无交叉反应;最低能检测到1.07fg的钩虫基因组DNA。通过临床样品检测,该方法比碘液染色镜检的检出率提高了9%,其敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为100%。结果表明,该PCR方法具有敏感、特异的特点,适用于钩虫的临床检测和钩虫病的分子流行病学调查。     

三株猫杯状病毒的分离鉴定及致病性研究

为了解猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)在广西地区的流行情况与致病性,本研究采集55份疑似FCV拭子,按常规方法分离鉴定得到3株FCV,以VP1基因进行同源性分析,在77.5%～85%之间,这3株分离株(2019)与广西株GX01(2013)、吉林株CH-JL4(2015)、上海株SH(2014)及英国株F65(1999)、哈尔滨株HRB-SS(2014)处于同一进化分支,具有相同的遗传起源,但与目前临床上使用的国内疫苗株255、国外疫苗株F9处于不同的进化分支,存在疫苗免疫失败的风险。为了解这3株FCV的毒力,进行动物致病性试验。结果显示,模拟自然感染的试验猫,FCV潜伏期最长为7 d,5～7 d为排毒的高峰期,FCV存在短暂病毒血症的情况。器官病变集中在肺部,会出现明显的淤血、出血现象。这3株的感染率均为100%,死亡率分别为50%、50%、75%,表明这3株FCV毒株均有致病性。综合剖检和HE染色结果分析,致病力最强的是GXN3株。     

猫细小病毒和猫疱疹病毒1型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测猫细小病毒（FPV）和猫疱疹病毒1型（FHV-1）的双重荧光定量PCR方法,针对FPV的VP2基因、FHV-1的UL21基因设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了双重荧光定量PCR方法,并绘制了标准曲线,其相关系数（R2）均为0.999,具有良好的线性关系。结果显示,FPV、FHV-1最低检测限分别为4.87和2.21 copies/μL;对猫的常见病毒及细菌均无非特异反应;批内、批间试验的变异系数均小于2%。证明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好。用建立的方法对178份样本进行检测,结果,FPV和FHV-1的阳性检出率分别为73.65%和16.85%,二者混感阳性率为15.73%,与临床确诊结果一致。上述结果表明,本研究建立的方法可用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、定量检测和流行病学调查等。     

猫杯状病毒的分离鉴定及其对理化因素抵抗力的研究

采集南京某宠物医院处置的疑似患猫杯状病毒病的家猫的鼻咽拭子,将其处理液接种于CRFK细胞,进行连续传代培养,出现特征性细胞病变。通过对该分离株进行形态学观察、PCR鉴定、间接免疫荧光试验,证明该分离株为猫杯状病毒(FCV),遂将其命名为FB-NJ-13。用RT-PCR分段扩增病毒基因组并将序列提交至GenBank(登录号:KM111557)。序列分析显示,该毒株与国内外参考毒株核苷酸序列的同源性在76.2%~79.6%之间。同时研究了该病毒对温度、酸碱、有机溶剂、干燥和紫外线照射等理化因素的抵抗力。结果显示,50℃30min或70℃5min即可灭活该病毒;该病毒在pH值为3的酸性环境中和pH值为10的碱性环境中不稳定;它对乙醚和氯仿不敏感;紫外线照射2.0h以上,可将该病毒有效灭活。上述研究结果为揭示我国FCV的分子生物学特征和遗传进化规律提供了重要的科学依据。     

猫疱疹病毒ERA-LFD检测技术的建立与应用

为建立一种快速检测猫疱疹病毒(FHV)的酶促恒温扩增-横向流动试纸条(ERA-LFD)方法,根据GenBank上FHV TK基因保守区域序列,设计多对ERA特异性引物用于筛选最佳引物对及探针,以现场快速检测FHV.灵敏性试验表明,该方法的检测限为7.86×101 copies/μL,比普通PCR的检测下限高10倍,与实...     

猪星状病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了建立特异、灵敏及快速的猪星状病毒3型(PAstV3)检测方法并应用于临床检测,根据GenBank登录的PAstV 3序列,在ORF1b保守区设计特异性引物和TaqMan探针;经过反应体系和反应条件优化,对建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行敏感性、特异性测定,并初步应用于临床粪便样品的检测。结果显示,该方法标准曲线线性关系良好,R2值达到0.997 1;与多种常见的猪病病毒均无交叉反应,特异性良好。与常规PCR相比,该检测方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高,批内、批间重复性试验的变异系数均小于2.0%,重复性良好。使用该方法对临床收集的30份疑似PAstV3粪便样本进行检测,阳性率为40%,检出率高于常规PCR方法。上述结果表明,该方法的建立为PAstV3的诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立

采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体,研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析,并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。     

高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株.以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价.结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×109～3.15×100copies/uL具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.998;最低检测限为3.15 copies/uL.对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%.表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

犬副流感病毒实时荧光RPA检测方法的建立

为快速监控犬猫科动物中犬副流感病毒(CPIV)的感染情况,本研究针对CPIV核衣壳蛋白基因的保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了CPIV实时荧光重组酶聚合酶等温扩增方法(real-time RPA)。结果表明,该方法具有良好的特异性,与其他犬病毒和同属的副黏病毒均未出现交叉反应;其敏感性与RT-PCR方法相近;将该方法应用于CPIV感染犬的临床组织样本、体表样本的检测,证实该实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA方法检测周期仅30min即可完成结果判读,满足了犬猫科动物CPIV快速检测的需要。     

猪嵴病毒RPA快速诊断方法的建立和应用

根据Gen Bank中公布的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)基因组序列,设计并合成特异性引物,构建阳性质粒标准品,以阳性标准品为模板建立猪嵴病毒的重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法,并对此方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒为模板时均未检测到特异性扩增条带,表明该方法具有良好的特异性;用3.36×10~7、3.36×10~6和3.36×10~5copies/L三个不同浓度的质粒标准品进行重复试验,均能扩增出特异性条带,表明该方法具有良好的重复性。10倍梯度稀释质粒标准品,此方法检测的最低限度为3.36×10~2copies/L的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对208份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示,猪嵴病毒阳性率为73.1%,明显高于常规RT-PCR的46.6%,两种方法的符合率为90.2%。上述结果表明,本研究建立的RPA方法可应用于猪嵴病毒的临床诊断及快速检测。     

猪嵴病毒RPA快速诊断方法的建立和应用

根据Gen Bank中公布的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)基因组序列,设计并合成特异性引物,构建阳性质粒标准品,以阳性标准品为模板建立猪嵴病毒的重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法,并对此方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒为模板时均未检测到特异性扩增条带,表明该方法具有良好的特异性;用3.36×10~7、3.36×10~6和3.36×10~5copies/μL三个不同浓度的质粒标准品进行重复试验,均能扩增出特异性条带,表明该方法具有良好的重复性。10倍梯度稀释质粒标准品,此方法检测的最低限度为3.36×102copies/μL的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对208份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示,猪嵴病毒阳性率为73.1%,明显高于常规RTPCR的46.6%,两种方法的符合率为90.2%。上述结果表明,本研究建立的RPA方法可应用于猪嵴病毒的临床诊断及快速检测。     

猴麻疹病毒抗体免疫梳检测方法的建立及应用

为了建立猴麻疹病毒(MeV)抗体的快速检测方法,本研究采用基因工程技术制备MeV的MeV-32基因原核表达产物即重组MeV-32蛋白作为抗原诊断试剂,以期建立免疫梳方法用于特异性检测实验猴血清中抗MeV的抗体Ig G。结果显示,最佳抗原包被量为0.1 mg/m L;制备好的免疫梳均能够特异性检测到相应的猴MeV阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应,表明该检测方法特异性强;敏感性分析结果表明,MeV-32蛋白能够敏感地检测到1∶100倍稀释的MeV阳性血清;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法在对10份可疑猴血清样品进行检测,免疫梳方法与ELISA检测结果一致率为100.0%,Kappa=1.000。上述结果表明,该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。