RNA干扰技术及其在寄生线虫基因功能研究中的应用

介绍了RNA干扰(RNAi)的概念、线虫中RNAi的作用机理、RNAi的三个分子特性,即可遗传性、转移性RNAi的放大效应和RNAi信号的传播特性。从模板dsRNA的获取、dsRNA的导入和线虫中RNAi效应的检测方法三个方面概述了应用RNAi技术研究线虫基因功能的试验方法和最新进展。     

RNA干涉技术及其应用的研究进展

RNA干涉 (RNAinterference ,RNAi)即内源性或外源双链RNA (double strandedRNA ,dsRNA )特异性结合互补链抑制细胞内特定基因的表达 ,或者通过双链RNA引发转录后基因沉默 (gene silencing) ,诱使出现特定基因表型缺失。这种现象已在真菌、线虫、拟南芥、斑马鱼、小鼠中被证实 ,可能是生物界普遍存在的一种保护基因组完整性和抵御外来核酸 (病毒和转座子 )入侵的一种RNA降解机制。自从在哺乳动物细胞中发现RNAi以来 ,随着对RNAi作用机理的阐明 ,其在抑制病毒复制、基因组功能研究以及基因治疗等方面的作用 ,已成为分子生物学研究…     

细胞因子及其应用的研究进展

概述了细胞因子的特性、分类及其基因转录和表达调控的机理,介绍了一些细胞因子在疾病诊断、治疗和预防方面的作用,对其在免疫学,特别是作为疫苗佐剂方面的应用前景进行了展望。     

长链非编码RNA在奶牛乳腺炎中作用机制的研究进展

奶牛乳腺炎是导致养牛业巨大经济损失的疾病,如今仍无有效防控方法。长链非编码RNA(LncRNA)既可以直接作用于m RNA,又可以通过调控mi RNA而间接作用于m RNA,从而影响下游靶基因及蛋白表达。LncRNA功能强大,广泛参与了染色体重构、核小体修饰、可变剪接、基因组印记、靶标模拟、功能性蛋白转运、转录干扰、细胞周期及分化等多种机体重要的生理和病理学调控过程。研究证实,lncRNA在奶牛乳腺炎中发挥重要作用。本文综述了奶牛乳腺炎和lncRNA的研究背景、lncRNA的生物学功能、lncRNA在奶牛乳腺炎体内外模型中的作用、lncRNA介导奶牛乳腺炎相关信号通路的机制,并对lncRNA在乳腺炎等炎性疾病的研究与应用前景方面进行了展望。     

鸭病毒性肝炎病毒RNA聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位

为研究鸭病毒性肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测了RNA依赖性RNA聚合酶在细胞中的表达和亚细胞定位情况。结果表明,RNA依赖性RNA聚合酶能与增强型绿色荧光蛋白一起在MDCK细胞中良好表达,且主要分布于细胞核中,Western-blot分析结果显示,融合蛋白在80ku处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性。表明成功构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现RNA依赖性RNA聚合酶主要在细胞核中发挥复制酶的功能。     

基于高通量测序的多房棘球蚴感染小鼠肝组织中差异circRNA的生物信息学分析

分析多房棘球蚴感染小鼠肝组织中差异表达的环状RNA(circRNA),探究circRNA在宿主感染过程中可能参与的调控作用。采用高通量circRNA芯片技术比较感染组和对照组小鼠肝组织circRNA表达谱的差异,利用生物信息学对差异circRNA亲本基因进行GO和KEGG富集分析。结果显示,上调表达的circRNA有201个,下调表达的circRNA有9个,差异表达共计210个,经实时荧光定量PCR验证出其中4个上调和2个下调差异circRNA的表达水平变化趋势与芯片结果相一致。GO富集分析显示,在分子功能、生物过程及细胞组分均有富集;KEGG富集通路则有内吞作用、SNARE蛋白相关囊泡运动、矿物质吸收等与免疫相关的信号通路。结果提示,感染多房棘球蚴的小鼠肝组织与对照组小鼠肝组织比较,circRNA表达谱发生了显著性变化,这些差异表达的circRNA及其潜在的靶分子可能与多房棘球蚴感染宿主早期免疫反应有关。     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株3′非编码区的克隆及结构分析

为了研究猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)SD0803株3′非编码区(3′-UTR)的结构及其在病毒复制与转录中的作用,采用病毒RNA 3′末端加Poly(A)尾的方法与3′RACE技术对SD0803株3′末端序列进行了扩增、克隆与测序,并应用Clustal W、CLC RNA Workbench 4软件对3′-UTR一级与二级结构进行分析。结果表明,SD0803株3′-UTR由186nt组成,与ZM-95、NADL、SD-1株核苷酸同源性分别为85.4%、53.8%、57.5%;SD0803与其他BVDV株一样,其一级结构均存在1个高变区与1个相对保守区;在高变区缺失约40nt;在RNA 3′末端二级结构方面,SD0803株与ZM-95株均具有3个茎-环结构,而与具有4个茎-环结构的牛源BVDV差异较大。     

应用RNA干扰技术对猪蛔虫性别相关基因功能的初步研究

针对编码猪蛔虫雌虫卵巢蛋白基因的EST序列设计了1对特异引物及连接T7启动子的引物,经PCR扩增,获得5′端连有T7启动子的双链DNA,在RNA聚合酶的作用下,转录合成dsRNA。通过浸泡的方式将dsRNA导入秀丽新杆线虫中,在浸泡后的5个不同的时间点,采用RT-PCR检测虫体浸泡后靶基因被干扰的效果。试验结果表明,在浸泡后的8~29 h能检测到同源靶标的存在;而在浸泡后的43~57 h不能检测到靶标RNA。另外,试验组没有观测到虫体明显的表型变化,而对照组在浸泡28 h后,发现部分线虫体内有发育成形的虫卵。初步认为导入虫体的dsRNA发生了干扰效应。     

利用RNA复制子融合表达口蹄疫病毒抗原表位与分子内佐剂的研究及其表达产物的免疫学分析

为了探究新型疫苗载体在口蹄疫防控中的应用,本研究构建了一种融合表达口蹄疫病毒抗原表位与分子内佐剂的RNA复制子.首先将FMDV毒株O/BY/2010 B、T表位及霍乱毒素B和α-干扰素基因构建到RNA复制子载体中,通过将复制子质粒线性化并进行体外转录,得到复制子RNA.将该RNA转染BHK-21细胞,用Western-...     

猪传染性胃肠炎病毒聚合酶基因反义RNA对病毒的抑制作用

通过PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)聚合酶部分片段,反向插入逆转录病毒表达载体pLXSN中,用脂质体法将重组质粒plxas-pol转染PA317细胞,经抗生素G418筛选出稳定的产毒细胞克隆,分别扩大培养后,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,细胞克隆产生的重组病毒效价达9.0×105CFU/mL。用高效价假病毒感染IBRS2细胞,再经抗生素G418筛选,提取细胞克隆总RNA,经RT-PCR证明plxas-pol整合入IBRS2细胞。以TGEV感染IBRS2细胞和具有抗性的IBRS2细胞所产生的细胞病变为指标,证明该反义RNA对病毒有明显抑制作用,抑制率约为80%。用2×103和4×102TCID50/mL剂量的TGEV感染时,引起细胞死亡的时间分别为21 h和27 h,与对照组相比,抗性细胞系可明显延迟因病毒感染引起细胞死亡的时间。     

应用反转录 - 聚合酶链技术快速检测猪瘟病毒RNA的研究

依据猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）５′端非编码区保守序列设计一对ＰＣＲ引物，建立了检测ＣＳＦＶ的反转录聚合酶链（ＲＴＰＣＲ）技术。应用该技术从猪瘟兔化弱毒感染兔的脾、淋巴结、肾与肌肉等以及石门株强毒感染猪的脾与肌肉和湖北分离毒株感染猪组织匀浆液中均特异扩增出了１条预期大小为１９４ｂｐ的片段，从实验感染兔和猪的血液中也特异扩增出了该片段，但对牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）和健康兔脾总ＲＮＡ以及健康猪的血液ＲＮＡ扩增均为阴性。采用这种方法，对实验感染兔脾总ＲＮＡ的检测灵敏度可达１０－８ｇ，表明其灵敏度足以达到临床检验的要求。     

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法,用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317,经G418筛选,获得数个稳定的产毒细胞克隆,择优挑选7个细胞克隆扩增培养,收集细胞上清,用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA,进行逆转录套式PCR,检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价,同时用传统方法(小鼠成纤维放大法)进行测定。2种方法检测结果的比较表明,逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法,是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。     

牛结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的原核表达及其在牛结核病检测中的应用

采用重组PCR技术从牛结核分枝杆菌AN5基因组DNA中扩增CFP10-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-CFP10/ESAT6.重组子经酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,获得约42 ku带有6×His蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%.用HIS蛋白纯化柱纯化该蛋白,Western-blot分析显示,该融合蛋白能与抗牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应.将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ,其特异性优于结核菌素.结果表明,获得的重组融合蛋白rHIS-CFP10/ESAT6为牛结核病的诊断奠定了基础.     

应用RNA干扰技术抑制捻转血矛线虫Hc38基因转录的研究

为研究RNA干扰对捻转血矛线虫Hc38基因转录的抑制作用,针对Hc38基因序列设计并合成特异性dsRNA、3对siRNAs(siRNA1,siRNA2,siRNA3),采用浸泡方式分别将dsRNA、siRNAs导入捻转血矛线虫感染性L3期幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Hc38基因在L3期幼虫中的相对含量以确定抑制效果。通过体外转录成功获得高浓度和高纯度的dsRNA,L3期幼虫经浸泡处理3d后,siRNAs组Hc38基因的相对含量分别为(14.93±1.75)%、(26.34±2.91)%和(15.86±2.54)%,dsRNA组为(32.27±1.50)%,均显著低于对照组。表明通过浸泡法导入的dsRNA和siRNAs均能有效抑制Hc38基因的转录,从而为捻转血矛线虫及其他寄生线虫的基因功能研究提供了一种新的方法。     

口蹄疫病毒感染机理的研究进展

介绍了口蹄疫病毒感染过程中的吸附、穿透和脱壳步骤。综述了病毒mRNA的翻译机理以及病毒转录和基因复制的机理。简要描述了病毒粒子的成熟过程,包括病毒RNA正链的装配以及VP0裂解成VP4和VP2的过程。     

猪生殖与呼吸综合征病毒5''''非翻译区序列的反向遗传操作

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美株感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR获得在病毒基因组5'非编码区(5'UTR)和ORF1起始密码子之间插入Nde Ⅰ的全长克隆pTLNd4,并以此为基础将5'UTR替换为欧洲株的5'UTR,获得全长克隆pTLV8.以体外转录的RNA转染MARC-145细胞.结果显示,pTLNd4产生了细胞病变(CPE),而pTLV8未产生.通过RT-PCR和Northern blot试验,分别对这2株突变病毒的基因组RNA复制和亚基因组mRNA转录水平进行了分析,同时还对pTLNd4进行了病毒学试验.证实,它们与亲本病毒无论从分子生物学水平或病毒学水平都无明显差异;pTLV8虽未产生CPE,但在病毒传代细胞中检测到了基因组RNA,说明替换不同基因型5'UTR的突变病毒虽然丧失了复制能力和感染性,但仍然能够提供病毒RNA合成所需要的顺式调控因子.     

猪生殖与呼吸综合征病毒5′非翻译区序列的反向遗传操作

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美株感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR获得在病毒基因组5′非编码区(5′UTR)和ORF1起始密码子之间插入NdeⅠ的全长克隆pTLNd4,并以此为基础将5′UTR替换为欧洲株的5′UTR,获得全长克隆pTLV8。以体外转录的RNA转染MARC-145细胞。结果显示,pTLNd4产生了细胞病变(CPE),而pTLV8未产生。通过RT-PCR和Northern blot试验,分别对这2株突变病毒的基因组RNA复制和亚基因组mRNA转录水平进行了分析,同时还对pTLNd4进行了病毒学试验。证实,它们与亲本病毒无论从分子生物学水平或病毒学水平都无明显差异;pTLV8虽未产生CPE,但在病毒传代细胞中检测到了基因组RNA,说明替换不同基因型5′UTR的突变病毒虽然丧失了复制能力和感染性,但仍然能够提供病毒RNA合成所需要的顺式调控因子。     

口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1( )中,重组质粒pcDNA3.1( )-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞,用纯化的目的蛋白进行Western-blotting鉴定,并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示,获得分子质量约55 ku的单一3D基因表达产物,其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术,证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。     

~（35）S标记的鼠干扰素γ和白细胞介素6RNA探针的制备和应用

分别制备由~（３５）标记的鼠干扰素γ（ＩＦＮγ）和白细胞介素６（ＩＬ－６）的ＲＮＡ探针，并用组织切片原位杂交技术检查了鼠肠道产生这两种细胞因子的阳性细胞的分布。结果表明，ＩＦＮγ和ＩＬ—６ｃＤＮＡ反义链ＲＮＡ探针具有高度特异性。     

猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以全长基因组重组质粒pSK-PTVFL为模板扩增了3D基因,并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a(+)中,阳性质粒转化BL21(DE3),阳性菌经0.3 mmol/L IPTG诱导后,进行Western-blotting检测。结果显示,3D蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的66.1%,且重组蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性反应。表明,3D蛋白能在大肠杆菌中高效表达,并具有良好的免疫原性,这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。